Remodelación y glicoconjugación de la hormona del crecimiento humano (hGH).

Un procedimiento in vitro sin células para formar un conjugado entre un péptido de la hormona del crecimiento humano (HGH) y un grupo modificador,

en el que el grupo modificador no es un azúcar de el grupo modificador está unido covalentemente con el glicopéptido mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, comprendiendo el glicopéptido un resto de glicosilo que tiene una fórmula que es un miembro seleccionado de:**Fórmula**

y en las que

10 a, b, c, d, i, j, k, l, m, r, s, t, u, z, aa, bb, cc,y ee son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1;

e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados delos números enteros entre 0 y 4;

n, v, w, x, y, y dd son 0;

R es un grupo modificador, una manosa o una oligomanosa y;

R' es un miembro seleccionado de H, un resto de glicosilo, un grupo modificador y un glicoconjugado, comprendiendo el procedimiento:

(a) poner en contacto el glicopéptido con una glicosiltransferasa y

comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.

Remodelación y glicoconjugación de la hormona del crecimiento humano (hGH)

Antecedentes de la invención La mayoría de los péptidos de origen natural contienen restos de hidratos de carbono unidos al péptido mediante enlaces específicos para un número seleccionado de aminoácidos a lo largo de la longitud de la cadena peptídica primaria. Por tanto, muchos péptidos de origen natural se llaman “glicopéptidos”. La variabilidad del patrón de glicosilación sobre cualquier péptido dado tiene enormes implicaciones para la función de ese péptido. Por ejemplo, la estructura de los glicanos ligados en N sobre un péptido puede afectar diversas características del péptido, que incluyen la susceptibilidad a proteasas, tráfico intracelular, secreción, selección de tejido como diana, semivida biológica y antigenicidad del péptido en una célula u organismo. La alteración de una o más de estas características afecta enormemente la eficacia de un péptido en su entorno natural, y también afecta la eficacia del péptido como agente terapéutico en situaciones en las que el péptido se ha generado para ese fin.

La estructura del hidrato de carbono unido a la cadena peptídica se conoce como una molécula de “glicano”. La estructura de glicano específica presente sobre un péptido afecta la solubilidad y características de agregación del péptido, el plegamiento de la cadena peptídica primaria y, por tanto, su actividad funcional o enzimática, la resistencia del péptido al ataque proteolítico y el control de la proteólisis que conduce a la conversión de formas inactivas del péptido en formas activas. Y, lo que es más importante, residuos de ácido siálico terminales presentes sobre la molécula de glicano afectan la longitud de la semivida del péptido en el aparato circulatorio de mamífero. Los péptidos cuyos glicanos no contienen residuos de ácido siálico terminales son rápidamente eliminados de la circulación por el hígado, un evento que invalida cualquier posible beneficio terapéutico del péptido.

Las estructuras de glicano encontradas en los glicopéptidos de origen natural se dividen normalmente en dos clases, glicanos ligados en N y ligados en O.

Los péptidos expresados en células eucariotas están normalmente N-glicosilados sobre residuos de asparagina en sitios en la estructura primaria del péptido que contienen la secuencia asparagina-X-serina/treonina en la que X puede ser cualquier aminoácido, excepto prolina y ácido aspártico. La porción de hidrato de carbono de tales péptidos se conoce como un glicano ligado en N. Los eventos tempranos de N-glicosilación se producen en el retículo endoplásmico (RE) y son idénticos en mamíferos, plantas, insectos y otros eucariotas superiores. Primero, una cadena de oligosacárido que comprende catorce residuos de azúcar se construye sobre una molécula portadora de lípidos. Como el péptido naciente se traduce y se translocaliza en el RE, la cadena de oligosacárido entera se transfiere al grupo amida del residuo de asparagina en una reacción catalizada por una enzima glicosiltransferasa unida a membrana. El glicano ligado en N se procesa adicionalmente tanto en el RE como en el aparato de Golgi. El procesamiento adicional generalmente implica la eliminación de algunos de los residuos de azúcar y la adición de otros residuos de azúcar en reacciones catalizadas por glicosilasas y glicosiltransferasas específicas para los residuos de azúcar eliminados y añadidos.

Normalmente, las estructuras finales de los glicanos ligados en N dependen del organismo en el que el péptido se produce. Por ejemplo, en general, péptidos producidos en bacterias están completamente sin glicosilar. Péptidos expresados en células de insecto contienen alta manosa, cadenas de oligosacáridos ligados en N de pauci-manosa, entre otros. Los péptidos producidos en cultivo celular de mamífero están normalmente glicosilados de forma diferente dependiendo, por ejemplo, de las especies y condiciones de cultivo celular. Incluso en las mismas especies y bajo las mismas condiciones, algunas veces se encuentra una cierta cantidad de heterogeneidad en la cadena de glicosilo. Además, los péptidos producidos en células vegetales comprenden estructuras de glicano que se diferencian significativamente de aquellas producidas en células animales. El dilema en la materia de la producción de péptidos recombinantes, particularmente cuando los péptidos van a usarse como agentes terapéuticos, es poder generar péptidos que están correctamente glicosilados, es decir, que pueden generan un péptido que tiene una estructura de glicano que se parece, o es idéntica a la presente, sobre la forma de origen natural del péptido. La mayoría de los péptidos producidos por medios recombinantes comprenden estructuras de glicano que son diferentes de los glicanos de origen natural.

Se han propuesto una variedad de procedimientos en la materia para personalizar el patrón de glicosilación de un péptido que incluye aquellos descritos en los documentos WO 99/22764, WO 98/58964, WO 99/54342 y la patente de EE.UU. nº 5.047.335, entre otros. Esencialmente, muchas de las enzimas requeridas para la glicosilación in vitro de péptidos se han clonado y secuenciado. En algunos casos, estas enzimas se han usado in vitro para añadir azúcares específicos a una molécula de glicano incompleta sobre un péptido. En otros casos, las células se han manipulado genéticamente para expresar una combinación de enzimas y péptidos deseados de forma que la adición de un resto de azúcar deseado a un péptido expresado se produzca dentro de la célula.

También pueden modificarse péptidos mediante la adición de glicanos ligados en O, también llamados glicanos tipo mucina, debido a su prevalencia en el glicopéptido mucinoso. A diferencia de los N-glicanos que están ligados a residuos de asparagina y se forman por transferencia en bloc de oligosacárido a partir de productos intermedios unidos a lípido, los O-glicanos están principalmente ligados a residuos de serina y treonina y se forman por la

adición escalonada de azúcares de azúcares de nucleótido (Tanner y col., Biochim. Biophys. Acta. 906:81-91 (1987) ; y Hounsell y col., Glycoconj. J. 13:19-26 (1996) ) . La función del péptido puede afectarse por la estructura de los glicanos ligados en O presentes sobre el mismo. Por ejemplo, la actividad del ligando P-selectina está afectada por la estructura de glicano ligado en O presente sobre la misma. Para una revisión de estructuras de glicano ligado en O véase Schachter y Brockhausen, The Biosynthesis of Branched O-Linked Glycans, 1989, Society for Experimental Biology, pág. 1-26 (Gran Bretaña) . Otros patrones de glicosilación se forman ligando glicosilfosfatidilinositol con el grupo carboxilo del extremo carboxilo de la proteína (Takeda y col., Trends Biochem. Sci. 20:367-371 (1995) ; y Udenfriend y col., Ann. Rev. Biochem. 64:593-591 (1995) .

Aunque actualmente existen diversas técnicas para modificar los glicanos ligados en N de péptidos, en la materia existe la necesidad de un procedimiento generalmente aplicable de producción de péptidos que tienen un patrón de glicosilación deseado, es decir, personalizado. Hay una necesidad particular en la materia de la glicosilación in vitro personalizada de péptidos, pudiendo producirse el péptido resultante a escala industrial. Esta y otras necesidades se satisfacen por la presente invención.

La administración de péptidos glicosilados y no glicosilados para generar una respuesta fisiológica particular es muy conocida en las ciencias médicas. Entre los péptidos mejor conocidos utilizados para este fin está la insulina, que se usa para tratar diabetes. También se han usado enzimas por sus beneficios terapéuticos. Un factor importante, que ha limitado el uso de péptidos terapéuticos, es la naturaleza inmunogénica de la mayoría de los péptidos. En un paciente, una respuesta inmunogénica a un péptido administrado puede neutralizar el péptido y/o conducir al desarrollo de una respuesta alérgica en el paciente. Otras deficiencias de los péptidos terapéuticos incluyen potencia inferior a la óptima y rápidas tasas de eliminación. Los problemas inherentes a los péptidos terapéuticos son reconocidos en la materia, y se han investigado diversos procedimientos de eliminación de los problemas. Para proporcionar péptidos terapéuticos solubles, polímeros sintéticos se han unido al esqueleto de péptido.

El poli (etilenglicol) (“PEG”) es un polímero ejemplar que se ha conjugado con péptidos. Se ha demostrado que el uso de PEG para derivatizar péptidos terapéuticos reduce la inmunogenicidad de los péptidos y prolonga el tiempo de eliminación de la circulación. Por... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento in vitro sin céluulas para formar un conjugado entre un péptido de laa hormona del crecimiento humano (HGH) y un grupo modificad dor, en el que el grupo modificador no es un azúcar de e origen natural, y en el que el grupo modificador está unido cova alentemente con el glicopéptido mediante un grupo de e enlace de glicosilo intacto,

comprendiendo el glicopéptido un re esto de glicosilo que tiene una fórmula que es un miem mbro seleccionado de:

y

en las que 10 a, b, c, d, i, j, k, l, m, r, s, t, u, z, aa, b bb, cc, y ee son miembros independientemente selecciionados de 0 y 1;

e, f, g y h son miembros independien ntemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 4;

n, v, w, x, y, y dd son 0;

R es un grupo modificador, una man nosa o una oligomanosa; y

R’ es un miembro seleccionado de H, un resto de glicosilo, un grupo modificaddor y un glicoconjugado,

comprendiendo el procedimiento:

(a) poner en contacto el glicoppéptido con una glicosiltransferasa y un donante de e glicosilo modificado, que comprende un resto glicosilo qque es un sustrato para la glicosiltransferasa coval lentemente unido al grupo modificador, en condiciones apr ropiadas para la formación del grupo de enlace de glicoosilo intacto.

2. El procedimiento de la reivindicaciión 1, que comprende además:

(b) antes de la etapa (a) , pone er en contacto dicho glicopéptido con una sialidasa e en condiciones apropiadas para eliminar ácido siálico de diccho glicopéptido.

3. El procedimiento de la reivindicaciión 1, que comprende además:

(c) antes de la etapa (a) , poner r en contacto el glicopéptido con endoglicanasa en co ondiciones apropiadas para escindir un resto glicosilo de dic cho glicopéptido.

4. El procedimiento de la reivindicaciión 1, que comprende además:

(c) antes de la etapa (a) , poner ansferasa y un donante de r en contacto dicho glicopéptido con una galactosiltra galactosa en condiciones aprop piadas para transferir dicha galactosa a dicho glicopépt tido.

5. El procedimiento de la reivindicaciión 1, que comprende además:

(d) poner en contacto el produ ucto de la etapa (a) con una sialiltransferasa y un do onante de ácido siálico en 30 condiciones apropiadas para tra ansferir ácido siálico a dicho producto.

6. El procedimiento de la reivindicaciión 1, que comprende además:

(d) antes de la etapa (a) , poner en contacto dicho glicopéptido con una galactosidasa en condiciones apropiadas para escindir un resto glicosilo d de dicho glicopéptido.

7. El procedimiento de la reivindica ación 1, en el que a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, , r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados dde 0 y 1;

n, v, w, xe y son 0; y z es 1.

8. El procedimiento de la reivindicaciión 1, en el que a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l, m, n, s, t, u, v v, w, x, e y son 0; i y r son miembros independienteme ente seleccionados de 0 y 1; y z es 1.

9. El procedimiento de la reivindicaciión 1, en el que a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m y n son 0 0; r, s, t, u, v, w, x e y son miembros inddependientemente seleccionados de 0 y 1; y z es 1.

10. El procedimiento de la reivindica ación 1, en el que aa y ee son miembros independiente emente seleccionados de 0 y 1; y bb, cc, y ddson 0.

11. El procedimiento de la reivindica ación 1, en el que aa, bb, cc, dd, y ee son 0.

12. El procedimiento de la reivindica ación 1, en el que aa, bb, cc, dd, ee, y n son 0.

13. El procedimiento de una cualqu uiera de las reivindicaciones precedentes, en el que e el grupo modificador es un polímero soluble en agua seleccion nado del grupo que consiste en péptidos sacáridos, ppoli (éteres) , poli (aminas) y poli (ácidos carboxílicos) .

14. El procedimiento de la reivindica ación 13, en el que el polímero hidrosoluble comprende e PEG.

15. Un conjugado de péptido de H HGH formado por el procedimiento de una cualquie era de las reivindicaciones precedentes, en el que el grupo de e enlace de glicosilo intacto está interpuesto entre, y uniddo covalentemente tanto a, el péptido como al grupo modificado or.

16. Un conjugado covalente entre u un péptido de la hormona del crecimiento humano (HG GH) y un grupo modificador que altera una propiedad del péptido o, en el que el grupo modificador está unido covalentemmente con el péptido en un resto glicosilo o aminoácido preselec ccionado del péptido mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto interpuesto entre, y unido covalentemente tanto a, el péptido como al grupo modificador; en el que el ggrupo modificador no es un azúcar de origen natural.

17. El conjugado covalente de la reiv vindicación 16, que comprende un resto glicosilo que tiiene la fórmula:

y

en las que a, b, c, d, i, j, k, l, m, r, s, t, u, z, aa, b bb, cc, y ee son miembros independientemente selecciionados de 0 y 1; e, f, g y h son miembros independien ntemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 4; n, v, w, x, y, y dd son 0; R es un grupo modificador, una man nosa o una oligomanosa; y

R’ es un miembro seleccionado de H, un resto de glicosilo, un grupo modificador y un glicoconjugado.

18. El conjugado covalente de la reivindicación 16 o 17, en el que el grupo modificador es un miembro seleccionado del grupo que consiste en un polímero hidrosoluble, un resto terapéutico, un marcador detectable, un grupo de enlace reactivo y un resto de dirección.

19. El conjugado covalente de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que el grupo modificador y un precursor del grupo de enlace de glicosilo intacto están unidos como una unidad unida covalentemente con el péptido mediante la acción de una enzima, convirtiendo la enzima el precursor en el grupo de enlace de glicosilo intacto, formando de este modo el conjugado.

20. El conjugado covalente de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en el que el grupo modificador es un 10 polímero hidrosoluble.

21. El conjugado covalente de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en el que el polímero hidrosoluble comprende poli (etilenglicol) .

22. Uso del conjugado covalente de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21 para la fabricación de un medicamento para tratar el enanismo en un mamífero.

23. Una composición farmacéutica que comprende un diluyente farmacéuticamente aceptable y un conjugado covalente entre un polímero soluble en agua y un péptido de la hormona del crecimiento humano (HGH) glicosilado o no glicosilado, en la que el polímero está conjugado con el péptido mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto interpuesto entre, y unido covalentemente tanto a, el péptido como al polímero; en la que el polímero hidrosoluble no es un azúcar de origen natural.