Remodelación y glicoconjugación de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF).

Un procedimiento in vitro sin células de formación de un conjugado covalente entre un péptido de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) glicosilado o no glicosilado y un polímero,

en el que el polímero está conjugado con el péptido mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto interpuesto entre y covalentemente ligado a tanto el péptido como al polímero, que comprende poner en contacto el péptido con una mezcla que comprende un azúcar de nucleótido ligado covalentemente con una mezcla que comprende un azúcar de nucleótido ligado covalentemente al polímero y una glicosiltransferasa para la que el azúcar de nucleótido es un sustrato bajo condiciones eficaces suficientes para formar el conjugado; en el que el polímero no es un azúcar que esté presente en la naturaleza

Remodelación y glicoconjugación de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)

Antecedentes de la invención La mayoría de los péptidos que existen de forma natural contienen restos de hidrato de carbono unidos al péptido mediante enlaces específicos para un número seleccionado de aminoácidos a lo largo de la longitud de la cadena peptídica primaria. Por tanto, muchos péptidos que existen de forma natural se denominan “glicopéptidos”. La variabilidad del patrón de glicosilación sobre cualquier péptido dado tiene enormes implicaciones para la función de ese péptido. Por ejemplo, la estructura de los glicanos ligados en N sobre un péptido puede afectar diversas características del péptido, que incluyen la susceptibilidad a proteasas, tráfico intracelular, secreción, elección de tejido como diana, semivida biológica y antigenicidad del péptido en una célula u organismo. La alteración de una o más de estas características afecta enormemente la eficacia de un péptido en su entorno natural, y también afecta la eficacia del péptido como agente terapéutico en situaciones en las que el péptido se ha generado para dicho fin.

La estructura del hidrato de carbono unido a la cadena peptídica se conoce como una molécula de “glicano”. La estructura de glicano específica presente sobre un péptido afecta la solubilidad y características de agregación del péptido, el plegamiento de la cadena peptídica primaria y, por tanto, su actividad funcional o enzimática, la resistencia del péptido al ataque proteolítico y el control de la proteólisis que conduce a la conversión de formas inactivas del péptido en formas activas. Y, lo que es más importante, residuos de ácido siálico terminales presentes sobre la molécula de glicano afectan la semivida del péptido en el aparato circulatorio de mamífero. Los péptidos cuyos glicanos no contienen residuos de ácido siálico terminales son rápidamente eliminados de la circulación por el hígado, un evento que invalida cualquier posible beneficio terapéutico del péptido.

Las estructuras de glicano encontradas en los glicopéptidos que existen de forma natural se dividen normalmente en dos clases, glicanos ligados en N y ligados en O.

Los péptidos expresados en células eucariotas están normalmente N-glicosilados sobre residuos de asparagina en sitios en la estructura primaria del péptido que contienen la secuencia asparagina-X-serina/treonina en la que X puede ser cualquier aminoácido, excepto prolina y ácido aspártico. La porción de hidrato de carbono de tales péptidos se conoce como un glicano ligado en N. Los eventos tempranos de N-glicosilación se producen en el retículo endoplásmico (RE) y son idénticos en mamíferos, plantas, insectos y otros eucariotas superiores. Primero, una cadena de oligosacárido que comprende catorce residuos de azúcar se construye sobre una molécula portadora de lípidos. Como el péptido naciente se traduce y se translocaliza en el RE, la cadena de oligosacárido entera se transfiere al grupo amida del residuo de asparagina en una reacción catalizada por una enzima glicosiltransferasa unida a membrana. El glicano ligado en N se procesa adicionalmente tanto en el RE como en el aparato de Golgi. El procesamiento adicional generalmente implica la eliminación de algunos de los residuos de azúcar y la adición de otros residuos de azúcar en reacciones catalizadas por glicosilasas y glicosiltransferasas específicas para los residuos de azúcar eliminados y añadidos.

Normalmente, las estructuras finales de los glicanos ligados en N dependen del organismo en el que el péptido se produce. Por ejemplo, en general, péptidos producidos en bacterias están completamente sin glicosilar. Péptidos expresados en células de insecto contienen alta manosa, cadenas de oligosacáridos ligados en N de pauci-manosa, entre otros. Los péptidos producidos en cultivo celular de mamífero están normalmente glicosilados de forma diferente dependiendo, por ejemplo, de las especies y condiciones de cultivo celular. Incluso en las mismas especies y bajo las mismas condiciones, algunas veces se encuentra una cierta cantidad de heterogeneidad en la cadena de glicosilo. Además, los péptidos producidos en células vegetales comprenden estructuras de glicano que se diferencian significativamente de aquellas producidas en células animales. El dilema en la materia de la producción de péptidos recombinantes, particularmente cuando los péptidos van a usarse como agentes terapéuticos, es poder generar péptidos que están correctamente glicosilados, es decir, que pueden generan un péptido que tiene una estructura de glicano que se parece, o es idéntica a la presente, sobre la forma que está presente en la naturaleza del péptido. La mayoría de los péptidos producidos por medios recombinantes comprenden estructuras de glicano que son diferentes de los glicanos que existen de forma natural.

Se ha propuesto varios procedimientos en la materia para personalizar el patrón de glicosilación de un péptido, incluyendo los descritos en los documentos WO 99/22764, WO 98/58964, WO 99/54342 y la patente de EE.UU. nº 5.047.335, entre otros. Esencialmente, muchas de las enzimas requeridas para la glicosilación in vitro de péptidos se han clonado y secuenciado. En algunos casos, estas enzimas se han usado in vitro para añadir azúcares específicos a una molécula de glicano incompleta sobre un péptido. En otros casos, las células se han manipulado genéticamente para expresar una combinación de enzimas y péptidos deseados de forma que la adición de un resto de azúcar deseado a un péptido expresado se produzca dentro de la célula.

También pueden modificarse péptidos mediante la adición de glicanos ligados en O, también llamados glicanos tipo mucina, debido a su prevalencia en el glicopéptido mucinoso. A diferencia de los N-glicanos que están ligados a residuos de asparagina y se forman por transferencia en bloc de oligosacárido a partir de productos intermedios unidos a lípido, los O-glicanos están principalmente ligados a residuos de serina y treonina y se forman por la adición escalonada de azúcares de azúcares de nucleótido (Tanner y col., Biochim. Biophys. Acta. 906:81-91 (1987) ; y Hounsell y col., Glycoconj. J. 13:19-26 (1996) ) . La función del péptido puede afectarse por la estructura de los glicanos ligados en O presentes sobre el mismo. Por ejemplo, la actividad del ligando P-selectina está afectada por la estructura de glicano ligado en O presente sobre la misma. Para una revisión de estructuras de glicano ligado en O véase Schachter y Brockhausen, The Biosynthesis of Branched O-Linked Glycans, 1989, Society for Experimental Biology, pág. 1-26 (Gran Bretaña) . Otros patrones de glicosilación se forman ligando glicosilfosfatidilinositol con el grupo carboxilo del extremo carboxilo de la proteína (Takeda y col., Trends Biochem. Sci. 20:367-371 (1995) ; y Udenfriend y col., Ann. Rev. Biochem. 64:593-591 (1995) .

Aunque actualmente existen diversas técnicas para modificar los glicanos ligados en N de péptidos, en la materia existe la necesidad de un procedimiento generalmente aplicable de producción de péptidos que tienen un patrón de glicosilación deseado, es decir, personalizado. Hay una necesidad particular en la técnica de la glicosilación in vitro personalizada de péptidos, pudiendo producirse el péptido resultante a escala industrial. Esta y otras necesidades se satisfacen mediante la presente invención.

La administración de péptidos glicosilados y no glicosilados para generar una respuesta fisiológica particular es muy conocida en las ciencias médicas. Entre los péptidos mejor conocidos utilizados para este fin está la insulina, que se usa para tratar diabetes. También se han usado enzimas por sus beneficios terapéuticos. Un factor importante, que ha limitado el uso de péptidos terapéuticos, es la naturaleza inmunogénica de la mayoría de los péptidos. En un paciente, una respuesta inmunogénica a un péptido administrado puede neutralizar el péptido y/o conducir al desarrollo de una respuesta alérgica en el paciente. Otras deficiencias de los péptidos terapéuticos incluyen potencia inferior a la óptima y rápidas tasas de eliminación. Los problemas inherentes a los péptidos terapéuticos son reconocidos en la materia, y se han investigado diversos procedimientos de eliminación de los problemas. Para proporcionar péptidos terapéuticos solubles, polímeros sintéticos se han unido al esqueleto de péptido.

El poli (etilenglicol) (“PEG”) es un polímero a modo de ejemplo que se ha conjugado con péptidos. Se ha demostrado que el uso de PEG para derivatizar péptidos terapéuticos reduce la inmunogenicidad de los péptidos y prolonga el... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento in vitro sin células de formación de un conjugado covalente entre un péptido de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) glicosilado o no glicosilado y un polímero, en el que el polímero está conjugado con el péptido mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto interpuesto entre y covalentemente ligado a tanto el péptido como al polímero, que comprende poner en contacto el péptido con una mezcla que comprende un azúcar de nucleótido ligado covalentemente con una mezcla que comprende un azúcar de nucleótido ligado covalentemente al polímero y una glicosiltransferasa para la que el azúcar de nucleótido es un sustrato bajo condiciones eficaces suficientes para formar el conjugado; en el que el polímero no es un azúcar que esté presente en la naturaleza.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el grupo de enlace de glicosilo está covalentemente unido a un residuo de glicosilo covalentemente unido al péptido.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el grupo de enlace de glicosilo está covalentemente unido a un residuo de aminoácido del péptido.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polímero comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste en un poli (óxido de alquileno) y un polipéptido, o en el que el polímero es un polímero soluble en agua.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el poli (óxido de alquileno) es poli (etilenglicol) .

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el poli (etilenglicol) tiene un grado de polimerización de aproximadamente 1 a aproximadamente 20.000.

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la glicosiltransferasa está seleccionada del grupo que consiste en sialiltransferasa, galactosiltransferasa, glucosiltransferasa, GalNAc transferasa, GlcNAc transferasa, fucosiltransferasa y manosiltransferasa.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la glicosiltransferasa se produce por recombinación.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el azúcar de nucleótido está seleccionado del grupo constituido por UDP-glicósido, CMP-glicósido y GDP-glicósido y está seleccionado preferentemente del grupo constituido por UDP-galactosa, UDP-galactosamina, UDP-glucosa, UDP-glucosamina, UDP-N-acetilgalactosamina, UDP-N-acetilglucosamina, GDP-manosa, GDP-fucosa, MFC-ácido siálico, MFC-NeuAc.

10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el péptido de FGF glicosilado se desglicosila parcialmente antes de la puesta en contacto.

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el grupo de enlace de glicosilo intacto es un residuo de ácido siálico.

12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el péptido se remodela antes de formar el conjugado, preferentemente, el péptido se remodela para introducir un resto aceptor para el grupo de enlace de glicosilo intacto.

13. Un conjugado covalente entre un péptido de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y un grupo modificador que altera una propiedad del péptido, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al péptido en un residuo de glicosilo o de aminoácido preseleccionado del péptido mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto interpuesto entre y ligado covalentemente a tanto el péptido como al grupo modificador; en el que el grupo modificador no es un azúcar que esté presente en la naturaleza.

14. El conjugado covalente de la reivindicación 13, en el que el grupo modificador es un miembro seleccionado del grupo que consiste en un polímero soluble en agua, un resto terapéutico, una etiqueta detectable, un grupo de ligador reactivo y un resto dirigido.

15. El conjugado covalente de las reivindicaciones 13 ó 14, en el que el grupo modificador y un precursor de grupo de enlace de glicosilo intacto se unen como una unidad covalentemente unida al péptido mediante la acción de una enzima, convirtiendo la enzima el precursor en el grupo de enlace de glicosilo intacto, formando así el conjugado.

16. El conjugado covalente de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que el grupo modificador es un polímero soluble en agua.

17. El conjugado covalente de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que el polímero soluble en agua comprende poli (etilenglicol) .

18. Una composición farmacéutica que comprende un diluyente farmacéuticamente aceptable y un conjugado covalente entre un polímero y un péptido de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) glicosilado o no glicosilado,

en la que el polímero está conjugado con el péptido mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto interpuesto entre y ligado covalentemente a tanto el péptido como al polímero; en el que el polímero no es un azúcar que esté presente en la naturaleza.

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