Proteínas de unión II al Factor de Necrosis Tumoral, su purificación y anticuerpos frente a los mismos.

EL FACTOR DE NECROSIS DE LOS TUMORES (FNT)Y SU PROTEINAAN ASOCIADA SON AISLADOS Y PURIFICADOS.

TIENE LA HABILIDAD DE INHIBIR EL EFECTO CITOTOXICO DEL FNT Y/O DE MANTENER SUS EFECTOS BENEFICIOSOS PROLONGADAMENTE. ESTA PROTEINA Y SUS SALES,D ERIVADOS FUNCIONALES, PRECURSORES Y FRACCIONES ACTIVAS PUEDEN EMPLEARSE PARA PARA ANTAGONIZAR LOS EFECTOS DELETEREOS DEL FNT. LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES Y POLICLONALES DE LA PROTEINA DE LA FNT TAMBIEN SE PRODUCEN MEDINATE ESTE INVENTO.

Esta invención se refiere a una nueva proteína (en lo sucesivo TBP-II) llamada Proteína que se fija a Factor de Necrosis Tumoral (TNF, del inglés Tumor Necrosis Factor), a sus sales, derivados funcionales, precursores y fracciones activas y mezclas de cualesquiera de los anteriores, que tienen la capacidad de inhibir el efecto citotóxico de TNF y/o mantener los efectos beneficiosos prolongados de TNF. La invención también se refiere a un procedimiento para la purificación de dicho TBP-II y a la proteína sustancialmente purificada, su clonación y su producción por técnicas de ADN recombinante. La invención también se refiere a anticuerpos frente a TBP-II y a sus fragmentos F(ab). Además, se refiere al uso de sus sales, derivados funcionales, precursores y fracciones activas y mezclas de cualesquiera de los anteriores, para antagonizar los efectos deletéreos de TNF y/o mantener sus efectos beneficiosos prolongados y al uso de los anticuerpos en ensayos de diagnóstico o como agentes para inhibir o simular los efectos de TNF sobre las células.

El Factor de Necrosis Tumoral (TNF-a ) y la Linfotoxina (TNF-b ) (en lo sucesivo, TNF se refiere tanto a TNF-a como a TNF-b ) son citocinas que tienen muchos efectos sobre las células (Wallach, D. (1986) en: Interferon 7 (compilado por Ion Gresser), págs. 83-122, Academic Press, London, y Beutler, B. y Cerami, A. (1987) New England J. Med. 316: 379-385). Tanto TNF-a como TNF-b inician sus efectos fijándose a receptores específicos de la superficie de las células. Algunos de los efectos probablemente serán beneficiosos para el organismo: por ejemplo, pueden destruir células tumorales o células infectadas con virus y aumentar las actividades antibacterianas de los granulocitos. De este modo, TNF contribuye a la defensa del organismo frente a agentes infecciosos y a la recuperación después de la agresión. Pero, de modo bastante evidente, tanto TNF-a como TNF-b también tienen efectos que pueden ser sumamente perjudiciales. Hay evidencias de que la producción excesiva de TNF-a puede desempeñar un papel patógeno fundamental en diversas enfermedades. Así, ahora se sabe que los efectos de TNF-a , principalmente sobre la vasculatura, son una causa fundamental de los síntomas del choque séptico (Tracey, K.J. y col. (1986) Science 234: 470-474). En algunas enfermedades, TNF puede ocasionar pérdida excesiva de peso (caquexia) porque suprime las actividades de los adipocitos y causa anorexia, así que TNF-a se denominó caquectina. También se describió como un mediador del daño a los tejidos en las enfermedades reumáticas (Beutler, op. cit.) y como un mediador fundamental del daño observado en las reacciones de injerto frente a organismo hospedador.

Por lo tanto, existe necesidad de encontrar la manera de eliminar o antagonizar TNF formado endógenamente o administrado exógenamente. Una tentativa en este sentido fue el aislamiento de una primera Proteína que se fija a TNF, llamada TBP-I, a partir de orina humana y se observó que era capaz de antagonizar los efectos de TNF. Este antagonismo se determinó tanto por medición de la disminución de la actividad citotóxica de TNF, como también por medición de la interferencia de la fijación de TNF a sus receptores.

La proteína TBP-I se describió por primera vez en la Solicitud de Patente Europea EP 308.378 publicada el 22 de Marzo de 1989, en que se describió un procedimiento para su purificación hasta homogeneidad a partir de orina humana por cromatografía sobre CM-Sepharose seguida de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC, del inglés High Performance Liquid Chromatography), en columnas Mono Q y Mono S y HPLC en fase inversa. La TBP-I homogénea así obtenida tenía un peso molecular aparente de aproximadamente 27.000 en electroforesis en gel de poliacrilamida (EGPA)-dodecilsulfato de sodio (DSS) tanto en condiciones reductoras como no reductoras. La homogeneidad de la proteína purificada se confirmó por análisis de microsecuencias, lo que reveló una sola secuencia N-terminal: Asp-Ser-Val-Cys-Pro-. La purificación parcial de proteínas que se fijan a TNFa , aparentemente similares a TBP-I, también fue descrita por Brockhaus y col., 2º Congreso Internacional sobre TNF y citocinas afines (15-20 de Enero de 1989), Abstract WA 140. Hommann y col. (1989), íbid., Abstract WA 143, describe experimentos de reticulación con proteínas receptoras de TNFa , pero no describen el aislamiento ni la purificación de dichas proteínas.

Se observó que TBP-I protegía a las células de la toxicidad de TNF a concentraciones de unos pocos nanogramos por ml e interfería con la fijación de tanto TNF-a como TNF-b a las células, cuando se aplicó simultáneamente con estas citocinas. Un examen adicional del mecanismo por el que funciona TBP-I reveló que TBP-I no interacciona con la célula diana, sino que en vez de esto bloquea la función de TNF porque se fija específicamente a TNF, compitiendo así por TNF con el receptor de TNF.

Consecuentemente a este hallazgo, se ha intentado una estrategia alternativa para la purificación de TBP-I, por la que se aplicaron proteínas de orina, o sus fracciones, sobre una columna de TNF inmovilizado y, después de separar las proteínas no fijadas, se eluyeron las proteínas que se fijaron a la columna, en forma biológicamente activa, por una disminución del pH. En el análisis EGPA-DSS, la mayor parte de la proteína en el eluato se movió como una sola banda ancha con tamaño molecular aparente de 30.000 ± 2.000.

Cuando se sometieron a fraccionamiento adicional por HPLC en fase inversa, las proteínas que eluyeron de la columna de TNF indicaron la presencia de dos componentes activos: uno, TBP-I, que eluye como es de esperar a una concentración de acetonitrilo de 27% y, además, una segunda proteína que se fija a TNF, denominada TBP-II, que eluye a una concentración de acetonitrilo algo más elevada (31%). Esta proteína que se fija a TNF es nueva y se llama aquí TBP-II. Ambas proteínas proporcionan protección contra el efecto citocida in vitro de TNF y ambos se fijan a TNF-b menos eficazmente que TNF-a . Aunque en el análisis de EGPA-DSS las dos proteínas, TBP-I y TBP-II, parecían tener un tamaño molecular muy similar, se pudieron distinguir claramente una de la otra por la falta de reactividad cruzada inmunológica, por las diferentes secuencias de aminoácidos N-terminales y por las diferentes composiciones de aminoácidos.

La presente invención proporciona una Proteína que se fija a TNF, llamada aquí TBP-II, sus sales, derivados funcionales, precursores y fracciones activas y mezclas de cualesquiera de los anteriores, que se fija a TNF específicamente y puede antagonizar los efectos deletéreos de TNF y/o mantener sus efectos beneficiosos prolongados. El antagonismo con respecto a TNF se determina midiendo selectivamente la disminución de actividad citotóxica de TNF, pero no de otros compuestos con algunas actividades similares a TNF, tales como interleucina-1 humana (IL-1).

La invención se refiere a dicha TBP-II en forma sustancialmente purificada, que está libre de impurezas proteicas y que se mueve como un solo pico en HPLC en fase inversa.

La invención también se refiere a un procedimiento para la purificación de TBP-II a partir de fluidos humanos, tales como orina.

Otro objeto de la invención es la producción de TBP-II por técnicas de ADN recombinante, que incluyen la preparación de secuencias de ADN que codifican TBP-II o de una proteína sustancialmente homóloga con ella, la construcción de vehículos de expresión que las contienen y de células hospedadoras transformadas con ellos, y el cultivo de dichas células transformantes en un medio adecuado de cultivo con el fin de producir TBP-II recombinante o una proteína sustancialmente homóloga con ella.

Otro objeto de la invención es proporcionar anticuerpos específicos para TBP-II y sus fragmentos F(ab), que se pueden utilizar en diagnóstico así como en productos farmacéuticos tanto para inhibir efectos tóxicos de TNF como para simular efectos beneficiosos de TNF en las células.

El TBP-II de la invención y sus sales, derivados funcionales, precursores y fracciones activas, y mezclas de cualesquiera de los anteriores, son para uso como ingredientes activos... [Seguir leyendo]

1. Una Proteína II (TBP-II) que se fija a Factor de Necrosis Tumoral (TNF) que tiene las siguientes características:

o sus sales, derivados funcionales, precursores o fracciones activas o mezclas de los anteriores, teniendo dichas fracciones la capacidad de inhibir el efecto citotóxico de TNF sobre las células y/o mantener su efecto beneficioso prolongado.

2. La TBP-II de la reivindicación 1, en forma sustancialmente purificada.

3. La TBP-II de la reivindicación 1 o 2, que tiene un peso molecular de aproximadamente 30 kDa cuando la proteína sustancialmente purificada se analiza por EGPA-DSS en condiciones reductoras.

4. La TBP-II de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se mueve como un solo pico en cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC) en fase inversa.

5. La TBP-II según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que tiene la capacidad de inhibir el efecto citotóxico de TNF-a sobre células A9 murinas.

6. La TBP-II según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que contiene la siguiente secuencia de amino-ácidos: Ala-Gln-Val-Ala-Phe-Thr-Pro-Tyr-Ala-Pro-Glu-Pro-Gly-Ser-Thr-Cys-Arg-Leu-Arg-Glu-Tyr-Tyr-Asp-Gln-Thr-Ala-Gln-Met-Cys-Cys- o una de sus formas truncadas.

7. Un procedimiento para el aislamiento de Proteína TBP-II sustancialmente purificada, que comprende:

8. La TBP-II según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, producida por el procedimiento de la reivindicación 7.

9. La TBP-II de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 8, en que la TBP-II es de origen humano.

10. La TBP-II de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o 9, que es una proteína recombinante.

11. La TBP-II de la reivindicación 10, que se produce en un hospedador procariótico, preferiblemente en E. coli, o en un hospedador eucariótico, preferiblemente en una célula de mamífero.

12. Una molécula de ADN que comprende una secuencia nucleotídica codificante de la TBP-II de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 8 a 11.

13. Un vehículo de expresión replicable, que comprende la molécula de ADN de la reivindicación 12 y es capaz, en una célula hospedadora transformante, de expresar la TBP-II definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 8 a 11.

14. Una célula hospedadora seleccionada entre una célula procariótica y una célula eucariótica, transformada con el vehículo de expresión replicable de la reivindicación 13.

15. Un procedimiento para producir TBP-II recombinante, que comprende las etapas de

16. Una composición farmacéutica que comprende TBP-II y/o sus sales, derivados funcionales, precursores o fracciones activas o mezclas de cualesquiera de los anteriores según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 8 a 11, como ingrediente activo, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, teniendo dichas fracciones la capacidad de inhibir el efecto citotóxico de TNF sobre las células y/o mantener su efecto beneficioso prolongado.

17. La composición farmacéutica según la reivindicación 16, para uso en el antagonismo del efecto deletéreo de TNF en mamíferos, especialmente en el tratamiento de procesos en que se forma endógenamente o se administra exógenamente exceso de TNF .

18. La composición farmacéutica según la reivindicación 16, para uso en el mantenimiento de los efectos beneficiosos prolongados de TNF en mamíferos, cuando se utiliza con TNF administrado exógenamente.

19. Un anticuerpo frente a TBP-II según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 8 a 11, que reconoce específicamente dicha proteína.

20. El anticuerpo según la reivindicación 19, que se caracteriza además porque bloquea la fijación de TNF a células U937 y K562.

21. El anticuerpo según la reivindicación 19 o 20, caracterizado además porque no bloquea la fijación de TNF a células HeLa y MCF7.

22. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, que es un anticuerpo policlonal.

23. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, que es un anticuerpo monoclonal.

24. El anticuerpo monoclonal según la reivindicación 23, producido a partir de un hibridoma formado por fusión de células de mieloma con células de bazo y/o linfocitos de ratones previamente inmunizados con TBP-II.

25. El anticuerpo monoclonal según la reivindicación 24, producido a partir de hibridoma TBP-II 13-12 (CNCM I-929).

26. El anticuerpo monoclonal según la reivindicación 24, producido a partir de hibridoma TBP-II 70-2 (CNCM I-928).

27. Una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 26, o sus fragmentos F(ab) o sales, derivados funcionales o fracciones activas del anticuerpo o de sus fragmentos junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

28. La composición farmacéutica según la reivindicación 27, para uso en el bloqueo de la fijación de TNF a, y la inhibición de su efecto sobre, las células.

29. La composición farmacéutica según la reivindicación 28, para uso en el tratamiento de procesos en que se han de antagonizar los efectos de TNF, ya sea formado endógenamente o administrado exógenamente.

30. La composición farmacéutica según la reivindicación 27, para uso en la simulación de los efectos beneficiosos de TNF sobre las células.

31. La composición farmacéutica según la reivindicación 27, para uso en la simulación del efecto citotóxico de TNF.

32. Un inmunoensayo in vitro para TBP-II en fluidos corporales, caracterizado por medir su interacción con un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 26.

33. La TBP-II según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 8 a 11, para uso en ensayos de diagnóstico para medir los niveles de anticuerpos frente a TBP-II producidos endógenamente en sueros de pacientes ante diversas enfermedades, preferiblemente ante enfermedades autoinmunes.

34. Un método para la purificación de TBP-II humana utilizando un anticuerpo adecuado según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 26, comprendiendo dicho método las etapas de: