INTERLEUCINA-10 PEGILADA.

Esta invención se refiere a IL-10 pegilada y a procedimientos para la preparación de IL-10 pegilada según se define en las reivindicaciones. Antecedentes de la invención La interleucina-10 de citosinas (IL-10) es un dímero que se hace biológicamente inactivo después de ruptura de las interacciones no covalentes que conectan sus dos subunidades monómeras. La IL-10 fue primeramente identificada como un producto del linfocito T cooperador de tipo 2 y más tarde se vio que era producida por otros tipos de linfocitos T cooperadores, incluidos linfocitos B y macrófagos. También inhibe la síntesis de varias citosinas producidas a partir de células cooperadoras T de tipo 1, tales como -interferón, IL-2 y factor de necrosis tumoral (TNF-). La capacidad de IL-10 de inhibir moduladores de respuesta inmune mediada por células y suprimir respuestas de linfocitos T dependientes de células que presentan antígeno demuestra que IL-10 tiene propiedades inmunosupresoras. Esta citosina también inhibe la producción de monocito/macrófago de otras citocinas tales como IL-1, IL-6, IL-8, factor estimulador de colonias de granulocito-macrófago (G-CSF) y TNF-. Como resultado de su actividad pleiotrópica, la IL-10 es objeto de investigación para numerosas aplicaciones clínicas tales como el tratamiento de afecciones inflamatorias, sepsis bacteriana, choque letal inducido por enterotoxina y enfermedades autoinmunes, por ejemplo, la artritis reumatoide, rechazo alográfico y diabetes. IL-10 tiene en el cuerpo una semivida relativamente corta en suero. Por ejemplo, la semivida en ratones medida en un bioensayo in vitro o por eficacia en el sistema de modelo de choque séptico [véase Smith y otros, Cellular Immunology 173:207-214 (1996)] es de aproximadamente 2 a 6 horas. Una pérdida de la actividad de IL-10 puede ser debida a varios factores, incluido aclaramiento renal, degradación proteolítica y monomerización en la corriente sanguínea. La pegilación de una proteína puede aumentar su semivida en suero retrasando el aclaramiento renal, puesto que el resto de PEG añade a la proteína un considerable radio hidrodinámico. Sin embargo, las metodologías de pegilación convencionales están dirigidas a proteínas monómeras y mayores, complejos unidos por disulfuro, por ejemplo anticuerpos monoclonales. La pegilación de IL-10 presenta problemas no encontrados con otras proteínas conocidas en la técnica, dado que el dímero IL-10 se mantiene unido por interacciones no covalentes. La disociación de IL-10, que puede ser intensificada durante la pegilación, dará por resultado monómeros de IL-10 pegilados (monómeros PEG-IL-10). Los monómeros PEG-IL-10 no retienen la actividad biológica de IL-10. También se señala que di-PEG­ IL-10, esto es, la pegilación en dos restos de aminoácido de IL-10, no retiene significativamente la actividad biológica. Los documentos WO99/32134, WO95/06058, WO01/58950 y WO96/11953 describen diferentes IL-10 pegiladas u otras proteínas. Sería una ventaja tener un producto de IL-10 que fuera más capaz de tolerar una exposición sistémica durante el tratamiento por intensificar la vida en circulación (aclaramiento demorado), la solubilidad y la estabilidad de IL-10 sin destruir la estructura dímera y afectar a la actividad de IL-10. La presente invención se dirige a esta y otras necesidades relacionadas en la técnica. Sumario de la invención ES 2 367 891 T3 La invención proporciona IL-10 pegilada (PEG-IL-10), más en particular mono-PEG-IL-10, procedimientos para producirla y composiciones farmacéuticas que contienen mono-PEG-IL-10, según se define en las reivindicaciones. En un aspecto, la invención es una mono-PEG-IL-10 que contiene de una a nueve moléculas de PEG covalentemente unidas mediante un conector al grupo -amino del resto de aminoácido del extremo N (extremo amino) de una subunidad de la IL-10. Así, esta mono-PEG-IL-10 de la presente invención puede expresarse por la fórmula: [X-O(CH2CH 2O n] b-L-NH-IL-10 en la que L es un conector que comprende un alquilo C2-12; b representa de 1 a 9 moléculas de PEG covalentemente unidas al conector L; n es de aproximadamente 20 a 2300, y representa las unidades repetidas de cada molécula de PEG unidas al conector L, pudiendo ser n el mismo o diferente para cada molécula de PEG, no excediendo de 2300 la suma de las unidades repetidas representadas por n para las moléculas de PEG; X es H o alquilo C 1-4 , y N es un nitrógeno del grupo amino del resto del aminoácido del extremo N de una subunidad de la proteína de IL-10 que está covalentemente unida al conector L. 2 Puesto que la suma de n para todas las moléculas de PEG no excede de 2300, la masa molecular total de las moléculas de PEG unidas al conector no excede aproximadamente de 100.000 Da. En una realización específica, el conector L de una PEG-IL-10 contiene un grupo propilo (por ejemplo, -CH2CH 2CH 2-) que está unido al extremo amino de la IL-10. En otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen mono-PEG-IL-10 estable según se define en las reivindicaciones. Esta invención proporciona además composiciones de PEG-IL-10 en las que al menos 80% de la PEG-IL-10 es la mono-PEG-IL-10 estable. La presente invención proporciona también composiciones de PEG-IL-10 en las que la población de mono-PEG-IL-10 es como mínimo en un 80% isómero posicional de mono-PEG-IL-10 que está pegilado en el extremo N de una subunidad de IL-10. En otro aspecto más, esta invención se refiere a un procedimiento para preparar PEG-IL-10, más en particular mono­ PEG-IL-10, haciendo reaccionar IL-10 con un conector de PEG-aldehido activado en presencia de un agente reductor para producir una PEG-IL-10 según se define en las reivindicaciones. Este procedimiento minimiza la ruptura de la estructura dímera de IL-10 de manera que no hay formación o sólo una pequeña formación de proteínas monómeras. En una realización particular de un procedimiento de la presente invención, un procedimiento para preparación de PEG-IL-10 incluye hacer reaccionar IL-10 con un conector de PEG-aldehído en presencia de un cianoborohidruro sódico, en el que la proporción molar de IL-10 a cianoborohidruro sódico es de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 1:15 formando una PEG-IL-10 a un pH de aproximadamente 6,3 a aproximadamente 7,5 a una temperatura de 18ºC a 25ºC de manera que el conector esté unido covalentemente a un resto de aminoácido de la IL-10. Estos y otros aspectos de la invención se explican más detalladamente en la siguiente descripción detallada de la invención. Descripción detallada de la invención ES 2 367 891 T3 Esta invención proporciona IL-10 pegilada (también designada aquí PEG-IL-10) según se define en las reivindicaciones. Una PEG-IL-10 de la invención contiene una o varias moléculas de polietilenglicol (PEG) unidas covalentemente a sólo un resto (mono) de la proteína de IL-10 mediante un conector, de manera que la unión de PEG es estable. Así, la pegilación se produce en un resto de aminoácido individual de la IL-10 para obtener una mono-PEG-IL-10. Al resto de aminoácido individual se puede unir más de una molécula de PEG a través de un conector que es capaz de acomodar más de una molécula de PEG. Un conector (para unión covalente a IL-10) usado en esta invención preferiblemente contiene un grupo aldehído que reacciona químicamente con un grupo amino o imino de un resto de aminoácido, por ejemplo, el grupo -amino del extremo N del polipéptido, el grupo -amino de la lisina. Con el fin de obtener una mono-PEG-IL-10 estable, se une una PEG al extremo amino o a un resto de lisina de IL-10 frente a un resto de histidina. Muy preferiblemente, una mono-PEG-IL-10 de esta invención contiene una o varias moléculas de PEG unidas por covalencia mediante un conector al grupo -amino del extremo N de una sola subunidad de IL-10. Se señala que una IL-10 que contiene una molécula de PEG es también conocida como una proteína conjugada, mientras que una proteína que carece de una molécula de PEG unida puede denominarse no conjugada. Las condiciones de reacción para la pegilación se seleccionan para minimizar la ruptura de la estructura dímera de IL-10. Así, la producción de IL-10 pegiladas monómeras, que no tienen la actividad de IL-10, se reduce por un procedimiento de la invención que se describe más adelante. Preferiblemente, las condiciones de reacción usadas en un procedimiento de la invención permiten la pegilación selectiva sobre el grupo -amino del extremo N de IL-10 (extremo N de PEG-IL-10) para minimizar la producción de otros isómeros posicionales de PEG-10, por ejemplo, His-PEG-IL-10 y Lys-PEG-IL-10. Es deseable y ventajoso tener un isómero posicional individual de un producto fármaco terapéutico por numerosas razones, incluidas aprobación de normas reguladoras, propiedades invariables,... [Seguir leyendo]

1. Una interleucina-10 monopegilada (mono-PEG-IL-10) que comprende una o varias moléculas de polietilenglicol (PEG) unidas covalentemente mediante un conector a un resto individual de aminoácido del homodímero IL-10, en la que el conector de PEG está unido al resto de aminoácido formando una unión hidrolíticamente estable con el grupo alfa-amino en el extremo N o con la cadena lateral de un resto de lisina, en la que en una proteína IL-10 entera que comprende dos unidades, sólo una subunidad está pegilada en un resto de aminoácido. 2. La mono-PEG-IL-10 de la reivindicación 1, en la que una o dos moléculas de PEG están unidas al mencionado resto individual de aminoácido. 3. La mono-PEG-IL-10 de la reivindicación 1, en la que una subunidad de la mencionada IL-10 tiene la fórmula: (PEG)b-L-NH-IL-10 en la que b es 1-9 y L es un resto conector alquilo C2-12 lineal unido covalentemente a un nitrógeno (N) del mencionado resto individual de aminoácido. 4. La mono-PEG-IL-10 de la reivindicación 3, en la que b es 1 y L es CH2CH 2CH 2-. 5. La mono-PEG-IL-10 de la reivindicación 1, en la que el PEG está unido covalentemente al nitrógeno del grupo alfa-amino del resto de aminoácido N terminal. 6. La mono-PEG-IL-10 de la reivindicación 1, en la que la mencionada IL-10 tiene la fórmula: [X-O(CH2CH 2O) n] b-L-NH-IL-10 en la que X es H o alquilo C1-4, n es de 20 a 2300, b es de 1 a 9 y L es un resto de conector alquilo C 2-12 que está unido covalentemente al nitrógeno (N) del grupo alfa-amino en el extremo amino de una subunidad de IL-10, con tal que, cuando b es mayor que 1, la totalidad de n no exceda de 2300. 7. La mono-PEG-IL-10 de la reivindicación 6, en la que L es CH2CH 2CH 2-. 8. La mono-PEG-IL-10 de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la mencionada mono-PEG-IL-10 tiene una actividad mayor que 30% de la actividad de IL-10 no conjugada. 9. Una composición de IL-10 pegilada que comprende la mono-PEG-IL-10 de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que la población de mono-PEG-IL-10 es como mínimo en un 80% un isómero posicional en el que el PEG está conjugado al aminoácido N-terminal de una subunidad de IL-10. 10. Una composición farmacéutica que comprende la mono-PEG-IL-10 de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 11. Uso de la mono-PEG-IL-10 de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en la fabricación de un medicamento. 12. Un procedimiento para preparar la mono-PEG-IL-10 de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende la etapa de: hacer reaccionar IL-10 con un conector PEG-aldehído activado en presencia de un agente reductor formando la mono-PEG-IL-10, en el que la relación de IL-10 a agente reductor es de 1:0,5 a 1:50, en el que el conector está unido covalentemente a un resto individual de aminoácido de la IL-10. 13. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que: ES 2 367 891 T3 (a) el agente reductor es cianoborohidruro sódico, (b) el conector PEG-aldehído activado es PEG-propionaldehído, (c) el PEG-es un metoxi-PEG, (d) el conector es de multibrazo, (e) la relación de IL-10 no conjugada al cianoborohidruro sódico es de 1:0,5 a 1:50, (f) la masa molecular total de todo el PEG que comprende el conector PEG-aldehído es de 3.000 daltons a 60.000 daltons, (g) la etapa de reacción se realiza a un pH de 5,5 a 7,8, o en el que (h) el procedimiento comprende además una etapa seleccionada entre el grupo constituido por: Incubar el producto mono-PEG-IL-10 en un tampón a pH de 5,0 a 9,0 y tratar la mono-PEG-IL-10 con sal hidrocloruro de hidroxilamina 0,05 a 0,4 M).. 14. El procedimiento de la reivindicación 12, que comprende la etapa de: hacer reaccionar la IL-10 no conjugada con un conector PEG-propionaldehído activado en presencia de 12 ES 2 367 891 T3 cianoborohidruro sódico, siendo la relación molar de IL-10 a cianoborohidruro sódico de 1:5 a 1:15, a un pH de 6,3 a 7,5 y a una temperatura de 18ºC a 25ºC formando la mono-PEG-IL-10, estando unido el conector covalentemente a un resto de aminoácido individual de la IL-10. 15. El procedimiento de la reivindicación 14, que además comprende una etapa seleccionada entre el grupo constituido por incubar el producto mono-PEG-IL-10 en un tampón TRIS a pH de 7,0 a 8,0 y tratar el producto mono­ PEG-IL-10 con sal hidrocloruro de hidroxilamina (0,05 a 0,4 M). 13