PROCEDIMIENTO PARA FIJAR MOLÉCULAS EFECTORAS A PROTEÍNAS.

Un procedimiento para fijar una o varias moléculas efectoras a una o a varias cisteínas en una proteína que comprende:

a) activar una o varias cisteínas en la proteína mediante diafiltración de la proteína frente a un agente reductor monotiol o un agente reductor multitiol que es incapaz de formar puentes disulfuro intramoleculares y b) hacer reaccionar la proteína tratada con una molécula efectora

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La presente invención se refiere a procedimientos para fijar moléculas efectoras a proteínas y más específicamente proporciona un procedimiento mejorado para la fijación específica del sitio de una o varias moléculas efectoras a una o a varias cisteínas en una proteína.

Las proteínas con moléculas efectoras fijadas se utilizan para una variedad de fines diferentes que incluyen los usos de diagnóstico y terapéuticos. La alta especificidad y afinidad, por ejemplo, de las regiones variables de un anticuerpo, las convierte en agentes ideales de diagnóstico y terapéuticos, particularmente para modular interacciones proteína:proteína. La función de dirigir hacia una diana, codificada en los fragmentos Fv, Fab, Fab', F(ab)2 y en otros fragmentos de anticuerpo, se puede conjugar con una o varias moléculas efectoras, tales como fármacos citotóxicos, toxinas o moléculas poliméricas para incrementar la eficacia. Por ejemplo, puesto que estos fragmentos carecen de una región Fc, tienen una semivida en la circulación corta en animales, pero esto se puede mejorar mediante la conjugación con ciertos tipos de polímero, tal como polietilenglicol (PEG). El incremento del tamaño del PEG conjugado se ha observado que incrementa la semivida en la circulación desde minutos hasta muchas horas y se ha mostrado la modificación de un Fab' con PEG en el intervalo de 5 kDa hasta 100 kDa (Chapman y col., 1999, Nature Biotechnology, 17,780-783; Leong y col., 2001, Cytokine, 16,106-119; Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Los fragmentos de anticuerpo PEGilados, tales como CDP870, se están utilizando actualmente en ensayos clínicos, en donde el efecto del PEG conjugado es conseguir que la semivida en la circulación llegue a niveles que sean aceptables para terapia.

Las moléculas efectoras se pueden fijar a una proteína a través de un grupo reactivo en la proteína que puede tener lugar de forma natural en la proteína o se introduce artificialmente mediante modificación de la proteína. Tales grupos incluyen aminas (lisina), tioles (cisteína, metionina), fenoles (tirosina), ácidos carboxílicos (ácido aspártico, ácido glutámico) u otras cadenas laterales de aminoácidos. El sitio de la fijación de las moléculas efectoras puede ser al azar

o específico del sitio, aunque la fijación específica del sitio se prefiere generalmente.

El residuo de tiol procedente del aminoácido cisteína que contiene azufre, es un grupo reactivo empleado generalmente que se puede utilizar para el acoplamiento selectivo de moléculas efectoras a proteínas. La fijación específica del sitio, por ejemplo, de moléculas efectoras a anticuerpos se consigue, en general, mediante la fijación de residuos de cisteína, puesto que tales residuos son relativamente poco comunes en fragmentos de anticuerpo. Las regiones bisagra de los anticuerpos son regiones comunes para la fijación específica del sitio, puesto que contienen residuos de cisteína y están alejadas de otras regiones del anticuerpo que probablemente están implicadas en la unión al antígeno. Las regiones bisagra adecuadas están presentes de forma natural o se pueden crear empleando técnicas de ADN recombinante (véanse, por ejemplo, los documentos US 5.677.425; WO98/25971; Leong y col., 2001 Cytokine, 16,106-119; Chapman y col., 1999 Nature Biotechnology, 17, 780-783). Alternativamente, las cisteínas específicas del sitio se pueden modificar en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo, para crear cisteína(s) expuesta(s) a la superficie (documento US 5.219.996).

Cuando las moléculas efectoras se tienen que fijar de forma específica del sitio, a través de una cisteína, el tiol diana en la proteína está recubierto frecuentemente con un producto peptídico pequeño relacionado con la fermentación, tal como glutatión o está recubierto deliberadamente con un aditivo químico empleado durante la extracción de la proteína

(p. ej., un fragmento de anticuerpo) y la purificación, tal como 5,5'-ditiobis (ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB). Los agentes de recubrimiento se tienen que eliminar para activar el tiol diana, antes de que se pueda fijar una molécula efectora. En muchos casos, es deseable activar selectivamente una o varias cisteínas diana para fijar la molécula efectora, sin reducir otras cisteínas dentro de la proteína. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo Fab' tienen un enlace disulfuro intercatenario natural, entre las regiones constantes de la cadena pesada y ligera (CH1 y CL) y de este modo reducen selectivamente una cisteína diana en otro lugar en el anticuerpo, p. ej., la región bisagra, la reducción se tiene que realizar con mucho cuidado para que el disulfuro entre CL:CH1 permanezca intacto y se evite la fijación de moléculas efectoras en las cisteínas intercatenarias. Por consiguiente, se emplean convencionalmente condiciones de reducción 'suaves' para eliminar el agente de recubrimiento del tiol y activar los tioles diana, antes de la reacción con una molécula efectora. Esta reducción suave se consigue generalmente incubando el fragmento de anticuerpo con un reductor a base de tiol, tal como º-mercaptoetanol (º-ME), º-mercaptoetilamina (º-MA) o ditiotreitol (DTT) (véase, por ejemplo, el documento EP0948544). Después de la reducción y la reacción con las moléculas efectoras (bajo esas condiciones), una gran parte de los fragmentos de anticuerpo no tienen ninguna molécula efectora fijada y éstas se tienen que purificar de forma aparte a los fragmentos de anticuerpo que tienen el número correcto de moléculas efectoras fijadas. Esta baja eficacia de la fijación de moléculas efectoras puede ser una desventaja durante la producción a gran escala de fragmentos de anticuerpo terapéuticos modificados, en donde es importante conseguir una eficacia de producción máxima.

La presente invención proporciona un procedimiento mejorado para la fijación selectiva de una o varias moléculas efectoras a una o a varias cisteínas en una proteína. En el procedimiento de la presente invención, una gran proporción de proteína está modificada correctamente, comparada con los métodos de la técnica anterior, incrementado de forma significativa la eficacia de la fijación de moléculas efectoras.

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Por lo tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para fijar una o varias moléculas efectoras a una o a varias cisteínas en una proteína que comprende:

a) activar una o varias cisteínas en una proteínas mediante la diafiltración de la proteína frente a un agente reductor monotiol o un agente reductor multitiol que es incapaz de formar puentes disulfuro intramoleculares y

b) hacer reaccionar la proteína tratada con una molécula efectora.

El término 'proteína' tal y como se emplea en esta memoria, incluye proteínas, polipéptidos y fragmentos de los mismos que contienen una o varias cisteínas que se pueden utilizar para la fijación de moléculas efectoras. Las proteínas se pueden modificar, p. ej., para producir variantes y fragmentos de los mismos, mientras que se conserve cuando sea necesario, la propiedad biológica deseada (p. ej., la capacidad de unirse a un sitio diana). Las proteínas se pueden modificar empleando diversas técnicas de ingeniería genética o proteica, por ejemplo, para introducir cisteínas en la proteína para emplear como sitios para la fijación de las moléculas efectoras. Por tanto, las cisteínas empleadas para la fijación de las moléculas efectoras pueden estar presentes de forma natural en la proteína y/o se pueden modificar en la proteína mediante técnicas de ADN recombinante. Por ello, el número y la posición de las cisteínas disponibles para la fijación de las moléculas efectoras, se pueden controlar específicamente dependiendo del uso destinado a la proteína y el número de moléculas efectoras necesarias.

Ejemplos de proteínas adecuadas incluyen, pero no están limitados a los mismos, enzimas, hormonas, anticuerpos, receptores, factores de crecimiento, proteínas séricas, tales como albúmina, lipoproteínas y fibrinógeno, enzimas fibrinolíticas, tales como activador tisular del plasminógeno (t-PA), estreptocinasa y urocinasa, modificadores de la respuesta biológica, tales como interleucinas, interferones y factores estimuladores de las colonias, eritropoyetina y hormonas peptídicas, tales como la hormona luteinizante, la hormona del crecimiento, gastrina, hormona estimuladora del folículo, TSH, ACTH, proteínas... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para fijar una o varias moléculas efectoras a una o a varias cisteínas en una proteína que comprende:

a) activar una o varias cisteínas en la proteína mediante diafiltración de la proteína frente a un agente reductor 5 monotiol o un agente reductor multitiol que es incapaz de formar puentes disulfuro intramoleculares y

b) hacer reaccionar la proteína tratada con una molécula efectora.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde un agente reductor monotiol o un agente reductor multitiol que es incapaz de formar puentes disulfuro intramoleculares, está presente en la muestra de proteína antes de la etapa (a).

10 3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la concentración de agente reductor en la muestra de proteína está entre 0,5 y 1,5 veces la concentración de agente reductor en el tampón de diafiltración.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la concentración de partida de agente reductor en la muestra de proteína es la misma que la concentración de agente reductor en el tampón de diafiltración.

5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la concentración de 15 agente reductor es 1 mM.

6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el agente reductor se retira de la muestra de proteína entre la etapa (a) y la etapa (b).

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el agente reductor se elimina por filtración en gel.

20 8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el agente reductor se elimina por diafiltración.

9. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el agente reductor se selecciona entre º-mercaptoetilamina, º-mercaptoetanol, glutatión o cisteína.

10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende adicionalmente la etapa (c) en la que la proteína con el número deseado de moléculas efectoras fijadas.

25 11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que se purifica la proteína es un anticuerpo o un fragmento del mismo.

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la proteína es un fragmento de anticuerpo Fab'.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en el que al menos una cisteína a la que se ha fijado una molécula efectora está presente en la región bisagra del anticuerpo.

30 14. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en el que cada cisteína a la que se ha fijado una molécula efectora está presente en la región bisagra del anticuerpo.

15. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que la molécula efectora es PEG.

16. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la molécula efectora es PEG-maleimida 40.000.