Un antagonista de leptina sintético que consiste en: (a) un polipéptido de leptina de mamífero en el que el sitio de unión hidrófobo LDFI en las posiciones correspondientes a las posiciones 39-42 de la secuencia de leptina humana de tipo salvaje,

está modificado de manera que de desde dos hasta cuatro residuos de aminoácido de dicho sitio de unión hidrófobo están sustituidos por diferentes residuos de aminoácido de manera que el sitio se vuelve menos hidrófobo, siendo dicho polipéptido un antagonista de leptina; o (b) un fragmento de dicho polipéptido de leptina de mamífero modificado de (a) que comprende dicho sitio de unión hidrófobo alterado, en el que dicho fragmento es por sí mismo un antagonista de leptina

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a antagonistas de leptina y, en particular, a mutantes de leptina, y a composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se notificó que el producto del gen ob, la leptina, suprimía el apetito mediante la regulación de las actividades de los centros de saciedad en el cerebro por medio de su receptor, denominado OB-R, y que afectaba al peso corporal (Friedman y Halaas, 1998). Sin embargo, estudios adicionales han mostrado que los receptores de leptina se expresan en muchos otros tejidos (Cioffi et al., 1996; Emilsson et al., 1997; Hoggard et al., 1997; Glasow et al., 1998; Briscoe et al., 2001), y han sugerido que la leptina está implicada en funciones biológicas más diversas que las esperadas previamente.

Investigaciones sistemáticas han demostrado que los niveles séricos de leptina están aumentados en seres humanos obesos como también lo están en diversos modelos animales de obesidad (Dagogo-Jack et al., 1996). Se ha notificado que el polipéptido OB o “leptina” reduce los niveles plasmáticos tanto de insulina como de glucosa en el ratón ob/ob genéticamente obeso (Pelleymounter et al., 1995). No ha habido hasta la fecha ninguna indicación de que mutaciones en el gen ob pudieran ser responsables de la frecuente aparición de obesidad en seres humanos.

El documento US 6.309.853 da a conocer polipéptidos OB y fragmentos de los mismos, y su uso para modular el peso corporal.

La diabetes no insulinodependiente (DMNID) o diabetes tipo II está provocada por resistencia a insulina, particularmente en el músculo esquelético, tejido adiposo e hígado. Por tanto, a pesar de la hiperinsulinemia, no hay suficiente insulina como para compensar la resistencia a la insulina y para mantener la glucemia en el intervalo deseable. El documento US 6.399.745 da a conocer el uso de antagonistas de leptina, que son fragmentos de leptina humana o murina, para tratar la diabetes tipo II y la resistencia a insulina en pacientes diabéticos. La solicitud de patente estadounidense n.º 2004/0048773 da a conocer el uso de un antagonista de leptina para el tratamiento de trastornos que resultan de deficiencias en la secreción de insulina y de hiperglucemia, pero no se da a conocer ningún antagonista de leptina específico en esta solicitud.

La solicitud de patente estadounidense n.º 2004/0072219 da a conocer una molécula modificada que tiene la actividad biológica de la leptina humana y que es sustancialmente no inmunogénica o menos inmunogénica que cualquier molécula no modificada que tenga la misma actividad biológica cuando se usa in vivo. Las proteínas de leptina variantes dadas a conocer se han diseñado mediante modelado por ordenador, pero no se han sintetizado ni sometido a prueba. Estas variantes tienen epítopos de células T alterados, preferiblemente mediante sustitución de un único aminoácido, para reducir o eliminar sitios inmunogénicos, mientras que se mantiene la actividad biológica de la leptina. Entre las secuencias dadas a conocer, están 13-meros en los que el residuo de aminoácido 39, 41 ó 42 de la leptina humana nativa se ha sustituido por alanina.

La obesidad se considera un factor de riesgo para muchos cánceres. A menudo, los niveles séricos de leptina están elevados en personas obesas. La leptina actúa como un agente mitogénico en muchos tejidos; por tanto, puede actuar promoviendo el crecimiento de células cancerosas. De hecho, se mostró que la leptina actuaba como un factor de crecimiento para células de cáncer de próstata in vitro, inducía un aumento de la migración de células de cáncer de próstata y la expresión de factores de crecimiento tales como factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-1) y factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), y potenciaba el crecimiento del cáncer de próstata. (Somasundar et al., 2004; Frankenberry et al., 2004).

Además de desempeñar un importante papel en la regulación de la ingesta de alimentos y el consumo de energía en el cerebro, la leptina también actúa como posible estimulador del crecimiento en células de cáncer de mama normales y neoplásicas. Se mostró también recientemente que inducía la proliferación celular en células de cáncer de ovario in vitro (Choi et al., 2004).

Se ha mostrado recientemente que la leptina promueve la diferenciación de células T auxiliares 1 (Th1) y modula a aparición y evolución de respuestas autoinmunitarias en varios modelos animales de enfermedad (La Cava y Matarese, 2004). Si el papel de la leptina es fundamental en enfermedades inflamatorias o enfermedades autoinmunitarias mediadas por Th1, tales como síndrome inflamatorio del intestino, entonces puede anticiparse un efecto terapéutico mediante el bloqueo que la acción periférica de la leptina (Matarese et al., 2005). Se ha mostrado también que la leptina está implicada en la patogénesis de la artritis reumatoide y en el desarrollo de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE), un modelo de ratón para la esclerosis múltiple (Peelman et al., 2004).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Se ha encontrado ahora, según la presente invención, que reduciendo la hidrofobicidad de un sitio de unión de leptina de mamífero en las posiciones 39-42, se obtienen mutantes de leptina que son antagonistas de leptina.

Por tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona un antagonista de leptina sintético que consiste en: (a) un polipéptido de leptina de mamífero en el que el sitio de unión hidrófobo LDFI en las posiciones correspondientes a las posiciones 39-42 de la secuencia de leptina humana de tipo salvaje, está modificado de manera que de desde dos hasta cuatro residuos de aminoácido de dicho sitio de unión hidrófobo están sustituidos por diferentes residuos de aminoácido de manera que el sitio se vuelve menos hidrófobo, siendo dicho polipéptido un antagonista de leptina;

o (b) un fragmento de dicho polipéptido de leptina de mamífero modificado de (a) que comprende dicho sitio de unión hidrófobo alterado, en el que dicho fragmento es por sí mismo un antagonista de leptina.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ADN aislada que codifica dicho antagonista de leptina.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende dicho antagonista de leptina sintético, o un fragmento del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Las figuras 1A-1C muestran la determinación de la pureza de los mutantes de leptina humana y ovina aislados. (A) Análisis de filtración en gel, (B) análisis de SDS-PAGE (gel al 15%), los carriles 1-5 corresponden a leptina humana de tipo salvaje (WT, wild type), mutantes de leptina L39A/D40A, F41A/I42A, L39A/D40A/F41A y L39A/D40A/F41A/I42A y los carriles 6-10 a leptina ovina de WT y sus mutantes, y (C) cromatografía de fase inversa.

La figura 2 muestra el análisis de filtración en gel de complejos entre el dominio de unión de leptina de pollo (chLBD) y leptina humana u ovina en una columna Superdex™ 75 HR 10/30. La formación de los complejos se llevó a cabo durante una incubación de 20 min. a temperatura ambiente en tampón TN usando diversas razones molares y entonces se aplicaron alícuotas (200 l) de la mezcla a la columna, equilibrada previamente con el mismo tampón. La concentración inicial de leptina (10 M) era constante en todos los casos. Se desarrolló la columna a 0,8 ml/min. y se calibró con albúmina sérica bovina (66 kDa), lactógeno placentario ovino (23 kDa) y lisozima (14 kDa). Se monitorizó la concentración de proteína en el eluato mediante la absorbancia a 220 nm.

Las figuras 3A-3B muestran el ensayo de radiorreceptor (RRA) usando homogeneizado de células BAF3 transfectadas de manera estable con la forma larga del receptor de leptina humana. Se usó 125I-leptina ovina como ligando y las leptinas humana (A) u ovina (B) o sus análogos como competidores.

Las figuras 4A-4B muestran la inhibición de la actividad de leptina mediante el mutante de leptina humana L39A/D40A/F41A/I42A. (A) Inhibición de la fosforilación inducida por leptina de MAPK (erk1/2) en un bioensayo de células de neuroblastoma humano SH-SY5Y (la figura superior muestra el efecto del aumento de la dosis de leptina) y (B) inhibición de la transactivación inducible por leptina del gen indicador de... [Seguir leyendo]

1. Un antagonista de leptina sintético que consiste en:

(a) un polipéptido de leptina de mamífero en el que el sitio de unión hidrófobo LDFI en las posiciones correspondientes a las posiciones 39-42 de la secuencia de leptina humana de tipo salvaje, está modificado de manera que de desde dos hasta cuatro residuos de aminoácido de dicho sitio de unión hidrófobo están sustituidos por diferentes residuos de aminoácido de manera que el sitio se vuelve menos hidrófobo, siendo dicho polipéptido un antagonista de leptina; o

(b) un fragmento de dicho polipéptido de leptina de mamífero modificado de (a) que comprende dicho sitio de unión hidrófobo alterado, en el que dicho fragmento es por sí mismo un antagonista de leptina.

2. Antagonista de leptina según la reivindicación 1, en el que dichos dos a cuatro residuos de aminoácido están sustituidos por aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en alanina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, lisina y serina.

3. Antagonista de leptina según la reivindicación 2, en el que dicho aminoácido es alanina.

4. Antagonista de leptina según la reivindicación 1, en el que dos de los cuatro residuos de aminoácido están sustituidos por alanina.

5. Antagonista de leptina según la reivindicación 4, en el que dicha leptina de mamífero nativa es leptina humana.

6. Antagonista de leptina según la reivindicación 5, en el que dicho antagonista de leptina humana es de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

7. Antagonista de leptina según la reivindicación 4, en el que dicha leptina de mamífero nativa es leptina ovina.

8. Antagonista de leptina según la reivindicación 7, en el que dicho antagonista de leptina ovina es de la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

9. Antagonista de leptina según la reivindicación 1, en el que tres de los residuos de aminoácido en cualquiera de las posiciones 39-42 de una secuencia de polipéptido de leptina de mamífero nativa están sustituidos por alanina.

10. Antagonista de leptina según la reivindicación 9, en el que dicha leptina de mamífero nativa es leptina humana.

11. Antagonista de leptina según la reivindicación 10, que consiste en el polipéptido de SEQ ID NO: 5.

12. Antagonista de leptina según la reivindicación 9, en el que dicha leptina de mamífero nativa es leptina ovina.

13. Antagonista de leptina según la reivindicación 12, que consiste en el polipéptido de SEQ ID NO: 6.

14. Antagonista de leptina según la reivindicación 1, en el que los cuatro residuos de aminoácido en las posiciones 39-42 de la secuencia de polipéptido de leptina humana nativa están sustituidos por alanina, consistiendo dicho antagonista de leptina en el polipéptido de SEQ ID NO: 7.

15. Antagonista de leptina según la reivindicación 1, en el que los cuatro residuos de aminoácido en las posiciones 39-42 de la secuencia de polipéptido de leptina ovina nativa están sustituidos por alanina, consistiendo dicho antagonista de leptina en el polipéptido de SEQ ID NO: 8.

16. Una molécula de ADN aislada que codifica un antagonista de leptina según la reivindicación 1.

17. Molécula de ADN según la reivindicación 16, seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de ADN de SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 y 16.

18. Fragmento de leptina sintético según la reivindicación 1, en el que de dos a cuatro residuos de aminoácido de la secuencia LDFI del sitio de unión hidrófobo en las posiciones 39-42 de un polipéptido de leptina de mamífero nativa están sustituidos por diferentes residuos de aminoácido de manera que el sitio se vuelve menos hidrófobo, siendo dicho fragmento un antagonista de leptina.

19. Antagonista de leptina sintético según la reivindicación 1, en forma pegilada.

20. Una composición farmacéutica que comprende un antagonista de leptina sintético o un fragmento del

mismo según la reivindicación 1, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21. Composición farmacéutica según la reivindicación 20, que comprende el antagonista de leptina sintético en forma pegilada.