CONJUGADOS DE ERITROPOYETINA (EPO) CON POLIETILENGLICOL (PEG).

Conjugado, comprendiendo dicho conjugado una glucoproteína eritropoyetina que presenta un grupo α

-amino Nterminal y que presenta la actividad biológica in vivo de causar que las células de médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y de glóbulos rojos, y seleccionado de entre el grupo que consiste de eritropoyetina humana y análogos de la misma, que presenta la secuencia de la eritropoyetina humana modificada mediante la adición de entre 1 y 6 sitios de glucosilación o una reorganización de por lo menos un sitio de glucosilación, en el que la reorganización comprende una deleción de cualquiera de los sitios de carbohidrato N-ligado en la eritropoyetina humana y/o una adición de la posición 88 del sitio de carbohidrato N-ligado de la secuencia de aminoácidos de la eritropoyetina humana, estando dicha glucoproteína unida covalentemente a un grupo poli(etilenglicol) de fórmula: -CO-(CH ) -(OCH CH ) -OR 2 x 2 2 m formando el -CO del grupo poli(etilenglicol) un enlace amida con dicho grupo α-amino N-terminal, en el que R es un grupo alquilo lineal o ramificado que presenta entre 1 y 6 átomos de carbono, x es 2 ó 3, y m presenta un valor entre aproximadamente 450 y aproximadamente 1.350

La eritropoyesis es la producción de glóbulos rojos, que con frecuencia se produce para compensar la destrucción de células. La eritropoyesis es un mecanismo fisiológico controlado que permite disponer de suficientes glóbulos rojos para la oxigenación correcta de los tejidos. La eritropoyetina (EPO) humana natural es producida por el riñón y es el factor plasmático humoral que estimula la producción de glóbulos rojos (Carnot P. y Deflandre C., C.R. Acad. Sci. 143:432, 1906; Erslev A.J. (Blood 8:349, 1953), Reissmann K.R., Blood 5:372, 1950, Jacobson L.O., Goldwasser E., Freid W. y Plzak L.F., Nature 179:6331-4, 1957. La EPO natural estimula la división y la diferenciación de los progenitores eritroides comprometidos situados en la médula ósea y ejerce su actividad biológica mediante la unión a receptores situados sobre los precursores eritroides (Krantz B.S., Blood 77:419, 1991).

La eritropoyetina ha sido fabricada biosintéticamente utilizando tecnología de ADN recombinante (Egrie J.C., Strickland T.W., Lane J. et al. Immunobiol. 72: 213-224, 1986) y es el producto de un gen EPO humano clonado que se ha insertado y expresado en las células del tejido ovárico de hámster chino (células CHO). La estructura primaria de la forma totalmente procesada predominante de la eritropoyetina humana (hEPO) se ilustra en la fig. 1. Existen dos puentes disulfuro entre Cys7-Cys161 y Cys29-Cys33. El peso molecular de la cadena polipeptídica de la EPO sin los grupos sacáridos es de 18.236 Da. En la molécula intacta de EPO, aproximadamente 40% del peso molecular está constituido por los grupos carbohidrato que glucosilan la proteína en sitios de glucosilación en la proteína (Sasaki H., Bothner B., Dell A. y Fukuda M., J. Biol. Chem. 262:12059, 1987).

Debido a que la eritropoyetina humana resulta esencial para la formación de glóbulos rojos, la hormona resulta útil en el tratamiento de trastornos sanguíneos caracterizados por una producción baja o defectuosa de glóbulos rojos. Clínicamente se utiliza la EPO en el tratamiento de la anemia en pacientes de insuficiencia renal crónica (CRF) (Eschbach J.W., Egri J.C., Downing M.R. et al. NEJM 316:73-78, 1987; Eschbach J.W., Abdulhsdi M.H., Browne J.K. et al., Ann. Intern. Med. 111:992, 1989; Egrie J.C., Eschbach J.W., McGuire T., Adamson J.W., Kidney Intl. 33:262, 1988; Lim V.S., Degowin R.L., Zavala D. et al. Ann. Intern. Med. 110:108-114, 1989) y en pacientes de SIDA y de cáncer sometidos a quimioterapia (Danna R.P., Rudnick S.A., Abels R.I., en: M.B. Garnick, editor, Erythropoietin in Clinical Applications-An International Perspective. New York, NY: Marcel Dekker, 1990: páginas 301 a 324). Sin embargo, la biodisponibilidad de las terapéuticas de proteínas disponibles comercialmente tales como EPO se encuentra limitada por su corta vida media en el plasma y su susceptibilidad a la degradación por proteasas. Por lo tanto, se han propuesto, por ejemplo, derivados de EPO para superar dichas desventajas.

Las rutas comunes para obtener proteínas pegiladas rinde mezclas de proteínas monopegiladas y oligopegiladas. Además, el compuesto polietilenglicol (PEG) se une en varias posiciones de las proteínas dependiendo de la cantidad y reactividades de los grupos reactivos disponibles sobre la superficie de la proteína. Este tipo de mezcla puede resultar en limitaciones graves: el PEG puede unirse en posiciones que interactúan con el receptor específico de la proteína y reducir drásticamente o incluso anular la eficacia terapéutica. Para resolver esta desventaja, resulta necesaria la separación y purificación de los ingredientes activos de este tipo de mezcla, o una ruta sintética selectiva para evitar su formación. Resulta evidente que evitar cualquier formación de mezclas facilita recibir un ingrediente farmacéutico activo puro en términos de un único isómero posicional a rendimientos esencialmente más altos. La separación de los isómeros posicionales de las mezclas de PEG-proteína puede incluso resultar imposible con las herramientas comunes a escala de producción.

Se mencionan ejemplos de mezclas de PEG-proteínas en las solicitudes de patente internacional WO nº 00/32772, WO nº 97/03106 y WO nº 00/42175. La patente WO nº 00/32772 se refiere a compuestos eritropoyéticos no glucosilados derivatizados con polímero y a métodos de preparación de estas proteínas que implican la utilización de un procedimiento de modificación de aldehído sin moléculas conectoras. La patente WO nº 97/03106 da a conocer poli(etilenglicol) y polímeros relacionados monosustituidos con ácidos propiónicos o butanoicos y derivados funcionales para aplicaciones biotecnológicas, por ejemplo la utilización de ésteres de succimidilo para producir conjugados de proteínas. La patente WO nº 00/42175 se refiere a métodos de preparación de proteínas solubles que presentan cisteínas libres en los que una célula huésped se expone a un agente bloqueante de cisteína. Las proteínas solubles producidas por los métodos seguidamente pueden modificarse para incrementar su efectividad. Entre dichas modificaciones se incluyen la unión de un grupo PEG para formar proteínas pegiladas.

Se han propuesto varios métodos para la modificación selectiva de polipéptidos producidos recombinantemente.

La solicitud de patente europea nº EP 651.761 da a conocer la modificación selectiva de polipéptidos producidos recombinantemente en grupos terminales reactivos de carbono α. La primera etapa en el método es formar un polipéptido producido recombinantemente de manera que se encuentre protegido en el grupo terminal reactivo de carbono α por un grupo protector añadido biológicamente. El grupo protector añadido biológicamente preferentemente es un aminoácido, péptido y/o polipéptido que contiene por lo menos un sitio que puede cortarse enzimática o químicamente, y preferentemente presenta una secuencia que no se encuentra presente en la secuencia del polipéptido deseado. Tras su formación, el polipéptido protegido biológicamente se hace reaccionar con agentes protectores químicos con el fin de proteger los grupos de cadena lateral, y después se corta con un reactivo de corte específico para el grupo protector añadido biológicamente. De esta manera se produce un polipéptido que presenta un grupo amino N-terminal no protegido y grupos reactivos de cadena lateral protegidos. Los grupos amino N-terminales no protegidos modificados con un agente modificador para formar un polipéptido modificado N-terminalmente y de cadenas laterales protegidas. A continuación se desprotege para formar un polipéptido modificado N-terminalmente. La patente EP nº 651.761 enseña que puede unirse cualquier secuencia de aminoácidos a modo de grupo protector añadido biológicamente. Sin embargo, en los sistemas de expresión de mamífero, la EPO se expresa con una secuencia de señal de líder que se corta con una peptidasa de señal con el fin de proporcionar la EPO madura procesada. Dichas peptidasas de señal reconocen únicamente residuos aminoácidos restringidos en el sitio de corte P1' y P3' (R.E. Dalbey et al. Protein Sci. 6:1129, 1997. En conclusión, un péptido protector añadido biológicamente debe construirse a partir de una secuencia de aminoácidos N-terminal de por lo menos tres aminoácidos para el corte de la secuencia de señal, seguido de una secuencia de aminoácidos para la eliminación enzimática o química del grupo protector. En el caso de que las secuencias de reconocimiento de tanto la peptidasa de señal como la proteasa de corte sean idénticas o estrechamente relacionadas, la secuencia del grupo protector añadido biológicamente puede reducirse a unos cuantos aminoácidos.

Además, se consiguió la modificación N-terminal selectiva mediante ligación quimioselectiva a una macromolécula diana funcionalizada con aldehído (o cetona) (solicitud de patente europea nº EP 788.375; Gaertner H.F., Offord R.E., Bioconjugate Chem. 7(1):38-44, 1996). Sin embargo, este método únicamente funciona para serinas o treoninas N-terminales.

La modificación selectiva en la alanina N-terminal se ha demostrado mediante transaminación de la alanina en piruvato (solicitudes de patente europea nº EP 964.705 y nº EP 605.963). La desventaja de dicho método es que el derivado de EPO que se forma muestra una actividad in vitro reducida. Además, los agentes de transformación Cu2+/ácido glioxílico/NaOAc probablemente producen reacciones secundarias dentro de la molécula de EPO.

También se demostró la modificación N-terminal específica de sitio mediante incorporación mediada por transglutaminasa de derivados poli(etilenglicol) (Sato H., Yamamoto K.,... [Seguir leyendo]

1. Conjugado, comprendiendo dicho conjugado una glucoproteína eritropoyetina que presenta un grupo α-amino N-terminal y que presenta la actividad biológica in vivo de causar que las células de médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y de glóbulos rojos, y seleccionado de entre el grupo que consiste de eritropoyetina humana y análogos de la misma, que presenta la secuencia de la eritropoyetina humana modificada mediante la adición de entre 1 y 6 sitios de glucosilación o una reorganización de por lo menos un sitio de glucosilación, en el que la reorganización comprende una deleción de cualquiera de los sitios de carbohidrato N-ligado en la eritropoyetina humana y/o una adición de la posición 88 del sitio de carbohidrato N-ligado de la secuencia de aminoácidos de la eritropoyetina humana, estando dicha glucoproteína unida covalentemente a un grupo poli(etilenglicol) de fórmula:

- CO-(CH)-(OCHCH)-OR

2x22m

formando el -CO del grupo poli(etilenglicol) un enlace amida con dicho grupo α-amino N-terminal, en el que R es un grupo alquilo lineal o ramificado que presenta entre 1 y 6 átomos de carbono, x es 2 ó 3, y m presenta un valor entre aproximadamente 450 y aproximadamente 1.350.

2. Conjugado según la reivindicación 1, de fórmula:

P-NHCO-(CH)-(OCHCH)-OR (I)

2x22m

en la que x, m y R son tal como se define en la reivindicación 1, y P es el residuo de la glucoproteína sin el grupo αamino N-terminal que forma un enlace amida con el grupo poli(etilenglicol).

3. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R es metilo.

4. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que m presenta un valor entre 550 y 1.000.

5. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que m presenta un valor entre aproximadamente 650 y aproximadamente 750.

6. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R es metilo y m presenta un valor entre aproximadamente 650 y aproximadamente 750.

7. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que presenta la fórmula:

CHO(CHCHO)CHCHCHCO-NH-P

322m222

en la que m presenta un valor entre 650 y 750, y P es tal como se define en la reivindicación 2.

8. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la glucoproteína es una eritropoyetina humana.

9. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la glucoproteína eritropoyetina humana se expresa mediante la activación de un gen endógeno.

10. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la glucoproteína presenta la secuencia mostrada en la fig. 1 ó en la fig. 2.

11. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la glucoproteína presenta la secuencia de la eritropoyetina humana modificada mediante la adición de entre 1 y 6 sitios de glucosilación.

12. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la glucoproteína presenta la secuencia de la eritropoyetina humana modificada con una modificación seleccionada de entre el grupo que consiste de:

30 32

Asn Thr ;

51 53

Asn Thr ,

57 59

Asn Thr ;

69

Asn ;

69 71

Asn Thr ;

68 6971

Ser Asn Thr ;

67 8890

Val Asn Thr ;

87 8890

Ser Asn Thr ;

87 888990

Ser Asn Gly Thr ;

87 889092

Ser Asn Thr Thr ;

Ser87Asn88Thr90Ala162;697187 8890

Asn Thr Ser Asn Thr ;

30 3287 88 90

Asn Thr Val Asn Thr ;

6990 91

Asn Ile Thr ;

67 8990 91

Ser Asn Ile Thr ; Asn136Thr138; Asn138Thr140;

125

Thr ; y

124 125

Pro Thr .

13. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la glucoproteína presenta la secuencia de la eritropoyetina humana modificada mediante una reorganización de por lo menos un sitio de glucosilación.

14. Conjugado según la reivindicación 13, en el que la reorganización comprende la deleción de cualquiera de los sitios de glucosilación N-ligada en la eritropoyetina humana y la adición de un sitio de glucosilación N-ligado en la posición 88 de la secuencia de la eritropoyetina humana.

15. Conjugado según la reivindicación 14, en el que la glucoproteína presenta la secuencia de la eritropoyetina humana modificada con una modificación seleccionada de entre el grupo que consiste de:

24 6788 90

Gln Ser Asn Thr ;

38 87 88 90

Gln Ser Asn Thr ; y

83 87 88 90

Gln Ser Asn Thr .

16. Composición farmacéutica que comprende un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

17. Utilización de un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para la preparación de medicamentos.

18. Procedimiento para la preparación de un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que comprende:

a) la expresión, y preferentemente la fermentación libre de suero, de una proteína EPO recombinante que comprende una extensión peptídica N-terminal que comprende una secuencia de corte proteolítico b) la protección de los grupos ε-amino, c) el corte proteolítico de la extensión peptídica N-terminal, d) la pegilación del grupo α-amino N-terminal, e) la desprotección de los grupos ε-amino de la glucoproteína eritropoyetina, f) en el que opcionalmente tras cada una de las etapas anteriormente indicadas puede realizarse una etapa de purificación.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que la EPO recombinante comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos mostradas en las figs. 1 a 5.

20. Procedimiento según la reivindicación 18 ó 19, en el que, en la etapa b), los grupos ε-amino se protegen mediante una citraconilación.

21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en el que el grupo α-amino N-terminal se pegila 5 con:

**(Ver fórmula)**

en la que R, m y X son tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

22. Compuestos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para la utilización en el tratamiento de enfermedades que se asocian a anemia en pacientes de insuficiencia renal crónica (CRF), SIDA y en pacientes de cáncer sometidos a quimioterapia.