Una preparación de nueva proteína estimulante de eritropoyetina químicamente modificada (NESP),

opcionalmente en un diluyente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable, donde dicha NESP es modificada químicamente con un compuesto químico seleccionado del grupo que consiste en dextrano, poli(N-vinil pirrolidona), polietilén glicoles, homopolímeros de propilén glicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados y polivinil alcoholes, y en donde la preparación es al menos 90% conjugado de polímero:proteína, y a lo sumo 10% de proteína que no ha reaccionado

Antecedentes de la invención

La nueva proteína estimulante de eritropoyetina (NESP) es un análogo de eritropoyetina hiperglicosilada que tiene cinco cambios en la secuencia de aminoácidos de rHuEPO que provee dos cadenas adicionales de carbohidrato. Más específicamente, la NESP contiene dos cadenas adicionales de carbohidrato enlazadas a N en los residuos aminoácidos 30 y 88 (numeración correspondiente a la secuencia de EPO humana) (ver la Solicitud PCT No. US 94/09257 (WO 9505465)).

La NESP es biológicamente distinta de EPO, tiene una vida media en suero más larga y una actividad biológica más alta in vivo; Egrie et al., ASH 97, Blood, 90:56a (1997). La NESP ha mostrado tener un incremento de 3 veces en la vida media en suero en ratones, ratas, perros y humanos; Id. En ratones, una vida media en suero más larga y una actividad más alta in vivo permite una dosificación menos frecuente (una vez a la semana o una vez cada dos semanas) en comparación con rHuEPO para obtener la misma respuesta biológica; Id.

Un estudio farmacocinético demostró que, consistente con los estudios en animales, la NESP tiene una vida media en suero significativamente mayor que rHuEPO en pacientes con insuficiencia renal crónica, lo cual sugiere que se puede emplear también un programa de dosificación menos frecuente en humanos; MacDougall, et al., J American Society of Nephrology, 8:268A (1997). Un programa de dosificación menos frecuente sería más conveniente tanto para médicos como para pacientes, y sería particularmente útil para aquellos pacientes que se administraron la medicación por sí mismos. Otras ventajas de una dosificación menos frecuente pueden incluir una menor cantidad de fármaco es introducida a los pacientes, una reducción en la naturaleza o severidad de los pocos efectos secundarios observados con la administración de rHuEPO, y una mayor conformidad.

Aunque una vida media extendida de NESP ofrece la ventaja de una dosificación menos frecuente con relación a EPO, todavía existen indicaciones potenciales, tales como quimioterapia, que puede requerir incluso de una vida media terapéutica más prolongada quee la que demuestra actualmente la NESP.

Una aproximación común utilizada a menudo para extender las vidas medias de las proteínas in vivo es la conjugación química de un polímero soluble en agua, tal como polietilén glicol (PEG), con la proteína de interés (véase M. L. Rucci et al, Advanced Drug Delivery Reviews, vol. 5, 1991 páginas 133 - 151, N. V. Katre, Advanced Drug Delivery Reviews, vol. 10, 1993, páginas 91 - 114). Generalmente, las moléculas de polietilén glicol se conectan a la proteína a través de un grupo reactivo encontrado sobre la proteína. Grupos amino, tales como aquellos sobre residuos de lisina o en el N-terminal, son convenientes para tal acoplamiento.

Se ha utilizado una variedad de métodos para unir las moléculas de polietilén glicol con la proteína (PEGilación). Por ejemplo, Royer (Patente de los Estados Unidos No. 4.002.531) establece que se utilizó alquilación reductiva para la unión de moléculas de polietilén glicol con una enzima. Davis et al. (Patente de los Estados Unidos No. 4.179.337) divulga conjugados de PEG:proteína que involucran, por ejemplo, enzimas e insulina. Shaw (Patente de los Estados Unidos No. 4.904.584) divulga la modificación de la cantidad de residuos de lisina en proteínas para la unión de moléculas de polietilén glicol a través de grupos reactivos amina. Hakimi et al. (Patente de los Estados Unidos No. 5.834.594) divulga conjugados de PEG:proteína solubles en agua sustancialmente no inmunogénicos, que involucran por ejemplo, las proteínas IL-2, interferón alfa, e IL-lra. Los métodos de Hakimi et al. involucran la utilización de enlazadores únicos para conectar los diferentes grupos amino libres en la proteína con PEG. Kinstler et al. (Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.824.784 y 5.985.265) enseña métodos que permiten proteínas selectivamente modificadas químicamente en el N-terminal y análogos de las mismas, incluyendo G-CSF e interferón de consenso. En forma muy importante, estas proteínas modificadas tienen ventajas con relación a la estabilidad de la proteína, e igualmente ofrecen ventajas en el procesamiento.

Los enfoques de PEGilación tales como los descritos anteriormente se aplican tradicionalmente a proteínas no glicosiladas derivadas de sistemas de expresión bacterianos con el propósito de hacer mejoras en solubilidad y en la vida media circulante in vivo (tales propiedades son conferidas típicamente a proteínas glicosiladas (glicoproteínas) a través de las estructuras funcionales de carbohidrato añadidas en el transcurso de la expresión eucariota). Los efectos de PEGilación sobre las vidas medias in vivo de proteínas no glicosiladas se presentan generalmente a través de la deriva de las propiedades fisicoquímicas y dinámicas de PEG que confieren un mayor volumen hidrodinámico y masa total al conjugado, reduciendo así la tasa de aclaramiento renal. Los beneficios adicionales incluyen típicamente mayor solubilidad y menor inmunogenicidad para el conjugado. Sin embargo, no todas las proteínas responden igualmente a la PEGilación y no existe garantía de un mejor desempeño.

La presente invención se basa en el hallazgo sorprendente de que una proteína altamente glicosilada, por ejemplo, NESP, puede ser PEGilada para proveer una composición farmacéutica con un perfil de duración incluso más dramáticamente sostenido que la NESP, permitiendo una dosis cada 4 - 6 semanas para elevar los hematocritos y tratar la anemia, y por lo tanto proporcionar una tremenda ventaja terapéutica.

**(Ver fórmula)**

Resumen de la invención

La presente invención se relaciona con una preparación de NESP químicamente modificada (o un análogo de la misma) y con métodos relacionados.

La presente invención se relaciona adicionalmente con una preparación de NESP químicamente modificada en el N-terminal (o un análogo de la misma).

La presente invención se relaciona adicionalmente con una preparación de NESP químicamente modificada representada como una población mixta ya sea de isoformas posicionales monosustituidas o formas polisustituidas.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 describe la estrategia de diseño para la PEGilación de NESP: (A) el tamaño del polímero de PEG varía entre 5 kD, 20 kD y 30 kD; (B) la conformación del polímero PEG puede ser bien lineal o ramificada con pesos moleculares totales de PEG de 10 kD, 20 kD o 40 kD; y (C) las preparaciones de PEG:NESP con diferentes grados de sustitución pueden ser aisladas para incluir: mono-PEG, di-PEG o, en algunos casos, tri-PEG de NESP.

La Figura 2 describe las diferentes químicas de reacción para la PEGilación de NESP: (A) alquilación reductiva de NESP con PEG-aldehído; (B) acilación de NESP con éster N-succinimidilo de PEG; y (C) PEGilación de las cadenas laterales de polisacárido de NESP por medio de oxidación limitada con peryodato del carbohidrato con el aldehído resultante que reaccionó con PEGhidrazida para formar un enlace de hidrazona seguido por posterior reducción con cianoborohidruro de sodio para estabilizar el enlace.

La Figura 3 es una gráfica que describe los datos de actividad in vivo de diferentes conjugados de poli-PEG:NESP de 5 kD vs. NESP no modificada (■). Las muestras -▲-, -▼-, -●-, y -♦- son mezclas de poli-PEG:NESP de 5 kD con grados progresivamente menores de sustitución. El grafica el % de absorción de hierro vs. los ng/mL administrados.

La Figura 4 es una gráfica que describe la prolongación de niveles elevados de hemoglobina (HGB) en respuesta al tratamiento con diferentes conjugados de PEG:NESP con relación a NESP no modificada. Se representa gráficamente una inyección única en bolo de 100 μg/kg de NESP (♦), conjugado de mono-PEG:NESP lineal de 20 kD derivado de metoxi-PEG activado con éster de NHS (■), conjugado lineal de 20 kD (80% de mono-PEG:NESP y 20% de di-PEG:NESP) derivado por medio de alquilación reductiva de PEG activado por aldehído (▼), y un control salino (●). Se representa gráficamente HGB (g/dL) vs. # de días después del tratamiento.

La Figura 5 es una gráfica que describe la prolongación de niveles elevados de reticulocitos en respuesta al tratamiento con diferentes conjugados de PEG:NESP con relación a NESP no modificada. Inyección única en bolo de 100 μg/kg de NESP (O), conjugados... [Seguir leyendo]

1. Una preparación de nueva proteína estimulante de eritropoyetina químicamente modificada (NESP), opcionalmente en un diluyente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable, donde dicha NESP es modificada químicamente con un compuesto químico seleccionado del grupo que consiste en dextrano, poli(N-vinil pirrolidona), polietilén glicoles, homopolímeros de propilén glicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados y polivinil alcoholes, y en donde la preparación es al menos 90% conjugado de polímero:proteína, y a lo sumo 10% de proteína que no ha reaccionado.

2. Una preparación de la reivindicación 1 que es al menos 95% conjugado de polímero:proteína y a lo sumo 5% de proteína que no ha reaccionado.

3. Una preparación de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2 donde dicha NESP es químicamente modificada con polietilén glicol.

4. Una preparación de la reivindicación 3 donde dicho polietilén glicol tiene un peso molecular de aproximadamente entre 2 kD y 100 kD.

5. Una preparación de la reivindicación 4 en donde dicho polietilén glicol tiene un peso molecular de aproximadamente entre 5 kD y 30 kD.

6. Una preparación de la reivindicación 1 en donde dicha preparación está compuesta de una población mixta de NESP mono-PEGilada y NESP poli-PEGilada.

7. Una preparación de la reivindicación 1 en donde dicha preparación está compuesta de al menos 95% de NESP mono-PEGilada en el N-terminal y a lo sumo 5% de NESP no PEGilada.

8. Una preparación de la reivindicación 1 en donde dicha NESP tiene la secuencia identificada en la SEQ. ID No. 1.

9. Una composición farmacéutica que comprende:

(a) una preparación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y

(b) un diluyente, estabilizador, preservante, solubilizador, emulsificante, adyuvante y/o portador farmacéuticamente aceptable.

10. Una composición de acuerdo con la reivindicación 9 en donde la preparación comprende al menos 95% del conjugado de polímero:proteína y a lo sumo 5% de NESP que no ha reaccionado.

11. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10 y que comprende:

(a) una preparación de NESP mono-PEGilada, consistiendo dicha NESP mono-PEGilada en una estructura funcional de polietilén glicol conectada con una estructura funcional de NESP únicamente en el N-terminal de la misma y menos de 5% de moléculas de NESP no PEGiladas; y

(b) un diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable.

12. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10 y que comprende:

(a) una preparación de NESP mono-PEGilada, consistiendo dicha NESP mono-PEGilada en una estructura funcional de polietilén glicol conectada con una estructura funcional de NESP a través de aldehídos generados en dichas cadenas de carbohidrato de NESP; y menos de 5% de moléculas de NESP no PEGiladas; y

(b) un diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable.

13. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10 y que comprende:

(a) una preparación de NESP mono-PEGilada, consistiendo dicha NESP mono-PEGilada en una estructura funcional de polietilén glicol conectada con una estructura funcional de NESP utilizando química de metoxi-PEG-NHS; y menos de 5% de moléculas de NESP no PEGiladas; y

(b) un diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable.

14. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10 y que comprende:

(a) una preparación de NESP PEGilada, comprendiendo dicha NESP PEGilada una población mixta de NESP mono-PEGilada y de NESP poli-PEGilada; y menos de 5% de moléculas de NESP no PEGiladas; y

(b) un diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable.

**(Ver fórmula)**

15. Una preparación de acuerdo con la reivindicación 1 para uso en un método para el tratamiento de un trastorno hematopoyético que comprende la administración de una dosis terapéuticamente efectiva de dicha preparación.

16. Un proceso para elaborar la preparación de la reivindicación 1 que comprende las etapas de:

(a) hacer reaccionar la NESP con un compuesto químico seleccionado del grupo que consiste en dextrano, poli(nvinil pirrolidona), polietilén glicoles, homopolímeros de propilén glicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados y polivinil alcoholes bajo condiciones mediante las cuales la NESP se une a uno o más grupos de PEG; y

(b) obtener el(los) producto(s) de reacción.

17. El proceso de la reivindicación 16 en donde la etapa (a) comprende alquilación reductiva para conjugar un PEG10 aldehído con una amina primaria de la NESP.

18. El proceso de la reivindicación 16 en la etapa (a) comprende acilación de las aminas primarias de NESP usando el éster de NHS de metoxi-PEG.

19. El proceso de la reivindicación 16 en donde la etapa (a) comprende

(i) la oxidación suave de NESP bajo condiciones seleccionadas para orientar el diol que pende de la penúltima 15 unidad de glicosilo del ácido siálico para oxidación hasta un aldehído;

(ii) la reacción del glicoaldehído resultante con una metoxi-PEG-hidrazida para formar una hidrazona semi-estable entre el PEG y NESP; y

(iii) la reducción de la hidrazona por medio de cianoborohidruro de sodio para producir un conjugado estable de PEG:NESP.