Anticuerpos contra CD40.

Un anticuerpo monoclonal, o una parte de unión a antígeno del mismo,

que se une específicamente a y activa elCD40 humano, en el que el epítope reconocido por dicho anticuerpo o por dicha parte no se solapa con el sitio deunión del ligando de CD40, en el que dicho anticuerpo o dicha parte inhibe el crecimiento tumoral in vivo, y en el que dicho anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en el que:

(a) las secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de dicha cadena pesada son las de un dominiovariable de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en:

i) el dominio variable de cadena pesada de 21.4.1 (Nº de Depósito ATCC PTA-3605);

ii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 42;y

iii) un dominio variable de cadena pesada codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 41; y

(b) las secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de dicha cadena ligera son las de un dominiovariable de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en:

i) el dominio variable de cadena ligera de 21.4.1 (Nº de Depósito ATCC PTA-3605);

ii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 44; y

iii) un dominio variable de cadena ligera codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 43.

Anticuerpos contra CD40

Antecedentes de la invención El antígeno CD40 es una glucoproteína de superficie celular de 50 kDa que pertenece a la familia de Receptores del Factor de Necrosis Tumoral (TNF-R) . (Stamenkovic y col., EMBO J. 8:1403-10 (1989) ) . El CD40 se expresa en muchos tipos de células normales y tumorales, incluyendo linfocitos B, células dendríticas, monocitos, macrófagos, epitelio tímico, células endoteliales, fibroblastos, y células del músculo liso. (Paulie S. y col., Cancer Immunol. Immunother. 20:23-8 (1985) ; Banchereau J. y col., Adv. Exp. Med. & Biol. 378:79-83 (1995) ; Alderson M.R. y col., J. of Exp. Med. 178:669-74 (1993) ; Ruggiero G. y col., J. Of Immunol. 156:3737-46 (1996) ; Hollenbaugh D. y col., J. of Exp. Med. 182:33-40 (1995) ; Yellin M.J. y col., J. of Leukocyte Biol. 58:209-16 (1995) ; y Lazaar A.L. y col., J. of Immunol. 161:3120-7 (1998) .) CD40 se expresa en todos los linfomas B y en el 70% de todos los tumores sólidos. Aunque el antígeno CD40 se expresa de manera constitutiva, se regula positivamente en células presentadoras de antígenos mediante señales de maduración, tales como LPS, IL-1 ! , IFN-∀ y GM-CSF.

La activación de CD40 desempeña una función crítica en la regulación de respuestas inmunitarias humorales y celulares. La presentación de antígenos sin activación de CD40 puede conducir a tolerancia, mientras que la señalización de CD40 puede invertir dicha tolerancia, mejorar la presentación de antígenos de todas las células presentadoras de antígenos (CPA) , conducir a la secreción de citocinas y quimiocinas auxiliares, aumentar la expresión y señalización de moléculas co-estimuladoras y estimular la actividad citolítica de células inmunitarias.

El antígeno CD40 desempeña una función crítica en la proliferación, maduración y cambio de clase de linfocitos B. (Foy T.M. y col., Ann. Rev. of Immunol. 14:591-617 (1996) ) . La alteración de la ruta de señalización de CD40 conduce a la distribución anómala de isotipos de inmunoglobulina en suero, a la ausencia de inducción de linfocitos T CD4+ y a defectos en respuestas humorales secundarias. Por ejemplo, el síndrome de hiper-IgM ligado al cromosoma X es una enfermedad asociada con una mutación en el gen CD40L humano caracterizada porque los individuos afectados no pueden producir anticuerpos diferentes de los del isotipo IgM, lo que indica que, para una respuesta inmunitaria eficaz, se requiere la interacción productiva entre CD40 y CD40L.

El acoplamiento de CD40 por CD40L conduce a la asociación del dominio citoplasmático de CD40 con los TRAF (factores asociados al TNF-R) . (Lee H.H. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1421-6 (1999) ; Pullen S.S. y col., Biochemistr y 37: 11836-45 (1998) ; Grammar A.C. y col., J. of Immunol. 161:1183-93 (1998) ; Ishida T.K. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9437-42 (1996) ; Pullen S.S. y col., J. of Biol. Chem. 274:14246-54 (1999) ) . La interacción con los TRAF puede culminar en la activación de las dos rutas NF#B y Jun/AP1. (Tsukamoto N. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1234-9 (1999) ; Sutherland C.L. y col., J. of Immunol. 162:4720-30 (1999) .) Dependiendo del tipo de célula, esta señalización conduce a mejorar la secreción de citocinas tales como IL-6 (Jeppson J.D. y col., J. of Immunol. 161:1738-42 (1998) ; Uejima Y. y col., Int. Arch. of Allergy & Immunol. 110:225-32, (1996) , IL-8 (Gruss H.J. y col., Blood 84:2305-14 (1994) ; von Leoprechting A. y col., Cancer Res. 59:1287-94 (1999) ; Denfeld RW. y col., Europ. J. of Immunol. 26:2329-34 (1996) ) , IL-12 (Cella M. y col., J. of Exp. Med. 184:747-52 (1996) ; Ferlin W.G. y col., Europ. J. of Immunol. 28:525-31 (1998) ; Armant M. y col., Europ. J. of Immunol. 26:1430-4 (1996) ; Koch F. y col., J. of Exp. Med. 184:741-6 (1996) ; Seguin R. y L.H. Kasper, J. of Infeet. Diseases 179:467-74 (1999) ; Chaussabel D. y col., Infection & Immunity 67:1929-34 (1999) ) , IL-15 (Kuniyoshi J.S. y col., Cellular Immunol. 193:4858 (1999) ) y quimiocinas (MIP1∃, MIP1!, RANTES, y otras) (McDyer J.F. y col., J. of Immunol. 162:3711-7 (1999) ; Schaniel C. y col., J. of Exp. Med. 188:451-63 (1998) ; Altenburg A. y col., J. of Immunol. 162:4140-7 (1999) ; Deckers J.G. y col., J. of the Am. Society of Nephrology 9:1187-93 (1998) ) , a aumentar la expresión del MHC de clase I y II (Santos-Argumedo L. y col., Cellular Immunol. 156:272-85 (1994) ) y a aumentar la expresión de moléculas de adhesión (por ejemplo, ICAM) (Lee H.H. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:1421-6 (1999) ; Grousson J. y col., Archives of Dermatol. Res. 290:325-30 (1998) ; Katada Y. y col., Europ. J. of lmmunol. 26:192-200 (1996) ; Mayumi M. Y col., J. of Allergy & Clin. Immunol. 96:1136-44 (1995) ; Flores-Romo L. y col., Immunol. 79:445-51 (1993) ) y moléculas coestimuladoras (por ejemplo, B7) (Roy M. y col., Europ. J. of Immunol. 25:596-603 (1995) ; Jones K.W. y C.J. Hackett, Cellular Immunol. 174:42-53 (1996) ; Caux C. y col., Journal of Exp. Med. 180:1263-72 (1994) ; Kiener P.A. y col., J. of Immunol. 155:4917-25 (1995) ) . Las citocinas inducidas por acoplamiento de CD40 mejoran la supervivencia y activación de linfocitos T.

Además de mejorar la función celular e inmunitaria, los efectos de la activación de CD40 incluyen: acumulación y diferenciación de células por quimiocinas y citocinas; activación de monocitos; actividad citolítica aumentada de linfocitos T citotóxicos (LCT) y linfocitos citolíticos naturales (NK) ; inducción de apóptosis en tumores CD40 positivos; potenciación de inmunogenicidad de tumores CD40 positivos; y producción de anticuerpos específicos de tumores. La función de la activación de CD40 en respuestas inmunitarias mediadas por células también está bien establecida, y se revisa en: Grewal y col., Ann. Rev. of Immunol. 16:111-35 (1998) ; Mackey y col., J. of Leukocyte Biol. 63:418-28 (1998) ; y Noelle R.J., Agents & Actions -Supl. 49:17-22 (1998) .

Estudios que utilizan un sistema de modelo de sensibilización cruzada demuestran que la activación de las CPA por CD40 puede reemplazar los requisitos de los linfocitos T auxiliares para la generación de linfocitos T citotóxicos (LCT) . (Bennett y col., Nature 393:478-480 (1998) ) . Pruebas realizadas con ratones que carecen de CD40L indican

un claro requisito para la señalización de CD40 en la inducción de linfocitos T auxiliares. (Grewal I.S. y col., Science 273:1864-7 (1996) ; Grewal I.S. y col., Nature 378:617-20 (1995) . Por otra parte, la activación de CD40 transforma a los linfocitos B, tolerogénicos, portadores de antígeno, en CPA competentes. (Buhlmann JE y col., Immunity 2:645-53 (1995) ) . La activación de CD40 induce la maduración y diferenciación de células progenitoras de sangre de cordón umbilical en células dendríticas. (Flores-Romo, L. y col., J. of Exp. Med. 185:341-9 (1997) ; Mackey M.F. y col., J. of Immunol. 161:2094-8 (1998) ) . La activación de CD40 también induce la diferenciación de monocitos en células dendríticas funcionales. (Brossart P. y col., Blood 92:4238-47 (1998., ) ) . Además, la activación de CD40 potencia la actividad citolítica de células NK a través de citocinas inducidas por CPA-CD40. (Carbone, E. y col., J. of Exp. Med. 185:2053-60 (1997) ; Martin-Fontecha A. y col., J. of Immunol. 162:5910-6 (1999) ) . Estas observaciones indican que el antígeno CD40 desempeña una función esencial en la iniciación y mejora de respuestas inmunitarias induciendo la maduración de las CPA, la secreción de citocinas auxiliares, la regulación positiva de moléculas coestimuladoras y la potenciación de funciones efectoras.

La función crítica de la señalización de CD40 en la iniciación y maduración de respuestas inmunitarias humorales y citotóxicas hace que este sistema sea una diana ideal para potenciar la respuesta inmunitaria. Dicha potenciación puede ser particularmente importante para crear respuestas inmunitarias eficaces contra antígenos tumorales, que generalmente se presentan contra el sistema inmunitario a través de sensibilización cruzada de las CPA activadas (Huang A.Y. y col., Ciba Foundation Symp. 187:229-44 (1994) ; Toes R.E.M. y col., Seminars in Immunol. 10:443-8 (1998) ; Albert M.L. y col., Nature 392:86-9 (1998) ; Bennett S.R y col., J. of Exp. Med. 186:65-70 (1997) .)

Diversos grupos han demostrado la eficacia de la activación de CD40 para respuestas antitumorales in vitro e in vivo. (Toes RE.M. y col., Seminars in Immunol. 10:443-8 (1998) ) . Utilizando un modelo metastásico pulmonar de carcinoma de células renales y tumores subcutáneos por células transformadas viralmente, dos grupos han demostrado independiente que la activación de CD40 puede invertir la tolerancia contra antígenos específicos de tumores, dando como resultado... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal, o una parte de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a y activa el CD40 humano, en el que el epítope reconocido por dicho anticuerpo o por dicha parte no se solapa con el sitio de unión del ligando de CD40, en el que dicho anticuerpo o dicha parte inhibe el crecimiento tumoral in vivo, y en el que dicho anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en el que:

(a) las secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de dicha cadena pesada son las de un dominio variable de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en:

i) el dominio variable de cadena pesada de 21.4.1 (Nº de Depósito ATCC PTA-3605) ; ii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 42; y iii) un dominio variable de cadena pesada codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 41; y

(b) las secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de dicha cadena ligera son las de un dominio variable de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en:

i) el dominio variable de cadena ligera de 21.4.1 (Nº de Depósito ATCC PTA-3605) ; ii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 44; y iii) un dominio variable de cadena ligera codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 43.

2. El anticuerpo, o parte de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, en el que:

(a) dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de un dominio variable de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en:

i) el dominio variable de cadena pesada de 21.4.1 (Nº de Depósito ATCC PTA-3605) ; ii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 42; y iii) un dominio variable de cadena pesada codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 41; y

(b) dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de un dominio variable de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en:

i) el dominio variable de cadena ligera de 21.4.1 (Nº de Depósito ATCC PTA-3605) ; ii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 44; y iii) un dominio variable de cadena ligera codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 43.

3. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que:

(a) dicha cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

i) la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 21.4.1 (Nº de Depósito ATCC PTA-3605) ; ii) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 46, o dicha secuencia de aminoácidos sin la secuencia señal; y iii) la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 45, o dicha secuencia de aminoácidos codificada sin la secuencia señal; y

(b) dicha cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

i) la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de 21.4.1 (Nº de Depósito ATCC PTA-3605) ; ii) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 48, o dicha secuencia de aminoácidos sin la secuencia señal; y iii) la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 47, o dicha secuencia de aminoácidos codificada sin la secuencia señal.

4. El anticuerpo, o parte de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de dicha cadena pesada y las secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de dicha cadena ligera son las secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEC ID Nº: 42 y las secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEC ID Nº: 44, respectivamente.

5. El anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las secuencias de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de dicha cadena pesada y del dominio variable de cadena ligera de dicha cadena ligera son la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 42 y la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 44, respectivamente.

6. Un anticuerpo monoclonal que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 46 sin la secuencia señal y la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 48 sin la secuencia señal.

7. Un anticuerpo monoclonal que es 21.4.1 (Nº de Depósito ATCC PTA-3605) o un anticuerpo que tiene las mismas secuencias de aminoácidos que 21.4.1 (Nº de Depósito ATCC PTA-3605) .

8. Un anticuerpo monoclonal humanizado, quimérico o humano, o parte de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a, y activa, el CD40, en el que dicho anticuerpo o dicha parte inhibe el crecimiento tumoral in vivo y en el que el anticuerpo o parte de unión a antígeno:

(a) compite en cruzado por la unión a CD40 con el anticuerpo 21.4.1 (Nº de Depósito ATCC PTA-3605) ; o

(b) se une al mismo epítope de CD40 que el anticuerpo 21.4.1 (Nº de Depósito ATCC PTA-3605) .

9. El anticuerpo, o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de la reivindicaciones 1-8, en el que dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno tiene al menos una propiedad seleccionada del grupo que consiste en:

(a) no unirse a linfocitos B de ratón, rata, perro y/o conejo;

(b) unirse a linfocitos B humanos, de mono cinomolgo y/o rhesus;

(c) tener una selectividad por CD40 que es al menos 100 veces mayor que su selectividad por el activador del receptor del factor nuclear kappa B (RANK) , 4-1BB (CD137) , el receptor del factor de necrosis tumoral 1 (TNFR-1) y el receptor del factor de necrosis tumoral 2 (TNFR-2) ;

(d) unirse a CD40 con un valor KD de 4 x 10-10 M o menor;

(e) tener un valor Koff para CD40 de 2 x 10-4 s-1 o menor;

(f) inhibir el crecimiento tumoral in vivo en presencia de linfocitos T humanos y/o de células dendríticas humanas;

(g) inhibir el crecimiento de tumores CD40 positivos en ausencia de células inmunitarias humanas;

(h) aumentar la expresión de ICAM, CMH-II, B7-2, CD71, CD23 y/o CD71 sobre la superficie de linfocitos B humanos;

(i) aumentar la secreción de IL-12p40, IL-12p70 y/o IL-8 por células dendríticas humanas;

(j) aumentar la expresión de ICAM, CMH-II, B7-2, y/o CD83 sobre la superficie de células dendríticas humanas;

(k) aumentar la expresión del interferón gamma por linfocitos T humanos durante una estimulación alogénica;

(l) unirse a CD40 humano en presencia de CD40L humano; y

(m) unirse a un epítope de CD40 humano contenido en el dominio 1 y dominio 2 del dominio extracelular de CD40.

10. El anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 que es:

(a) una inmunoglobulina G (IgG) , una IgM, una IgE, una IgA o una molécula IgD, o derivada de estas; o

(b) un fragmento Fab, un fragmento F (ab’) 2) , un fragmento Fv, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo biespecífico.

11. Una línea celular que produce el anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10.

12. La línea celular de acuerdo con la reivindicación 11 que produce el anticuerpo 21.4.1 (Nº de Depósito ATCC PTA-3605) o un anticuerpo que tiene las mismas secuencias de aminoácidos que el anticuerpo 21.4.1 (Nº de Depósito ATCC PTA-3605) .

13. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada o una parte de unión a antígeno de la misma, una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera o una parte de unión a antígeno de la misma, o secuencias de nucleótidos que codifican las cadenas tanto ligera como pesada o partes de unión a antígeno de las mismas, de un anticuerpo o de una parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de la reivindicaciones 1-10.

14. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 13, en la que dicha molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada o una parte de unión a antígeno de la misma de 21.4.1 (Nº de Depósito ATCC PTA-3605) ;

(b) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera o una parte de unión a antígeno de la misma de 21.4.1 (Nº de Depósito ATCC PTA-3605) ;

(c) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nos: 42, 44, 46 y 48, o dicha secuencia de aminoácidos sin una secuencia señal si esta está presente; y

(d) una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nos: 41, 43, 45 y 47, o dicha secuencia sin una secuencia de nucleótidos que codifique una secuencia señal si esta está presente.

15. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, en el que el vector comprende opcionalmente una secuencia de control de expresión unida operativamente a la molécula de ácido nucleico.

16. Una célula huésped que comprende:

(a) una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada o una parte de unión a antígeno de la misma y una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera o una parte de unión a antígeno de la misma, o una secuencia nucleótidos que codifica las cadenas tanto pesada como ligera o partes de unión a antígeno de las mismas, de un anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10; o (b) el vector de acuerdo con la reivindicación 15.

17. Un procedimiento de fabricación de un anticuerpo anti-CD40 o una parte de unión a antígeno del mismo, que comprende cultivar la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 16 o la línea celular de acuerdo con la 10 reivindicación 11 en condiciones adecuadas y recuperar dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno.

18. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. El anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 para su uso en el tratamiento de cáncer o para potenciar una respuesta inmunitaria.

20. El anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10 para su uso en el tratamiento de un tumor CD40 negativo.

21. Un medicamento que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada o una parte de unión a antígeno de la misma y una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera o una parte de unión de la misma, o una secuencia de nucleótidos que codifica las cadenas tanto pesada como ligera o partes de unión a antígeno de las mismas, de un anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de la reivindicaciones 1-10, para su uso en el tratamiento de cáncer o para potenciar una respuesta inmunitaria.