Proteínas de fusión de la albúmina.

Una proteína de fusión de la albúmina que comprende dos o más polipéptidos de GLP-1 orientados en tándem,

enla que

(i) dichos polipéptidos GLP-1 se seleccionan de

(a) GLP-1 de tipo silvestre;

(b) GLP-1 (9-36);

(c) GLP-1 (7-36);

(d) GLP-1 (7-36(A8G));

(e) GLP-1 (7-36(A8S)); y

(f) otros fragmentos de GLP-1 y/o variantes de GLP-1 que tienen actividad de GLP-1, fusionados aalbúmina, que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1038, un fragmento dealbúmina, o variante de albúmina de la misma,

(ii) dicho fragmento de albúmina o variante de albúmina aumenta la semivida plasmática en suero de lospolipéptidos GLP-1 y

(iii) dicha proteína de fusión tiene actividad GLP-1.

Proteínas de fusión de la albúmina

Antecedentes de la invención La invención se refiere, en general, a una proteína de fusión de la albúmina que comprende dos o más polipéptidos 5 de GLP-1 orientados en tándem, en la que (i) dichos polipéptidos GLP-1 se seleccionan de

(a) un GLP-1 silvestre

(b) GLP-1 (9-36) ;

(c) GLP-1 (7-36) ;

(d) GLP-1 (7-36 (A8G) ) ;

(e) GLP-1 (7-36 (A8S) ) ; y

(f) otros fragmentos de GLP-1 y/o GLP-1, variantes que tienen actividad de GLP-1;

condensados con albúmina, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1038, un fragmento de albúmina, o variante de albúmina de la misma.

(ii) dicho fragmento de albúmina o variante de albúmina aumenta la semivida plasmática en suero de los polipéptidos GLP-1 y

(iii) dicha proteína de fusión tiene actividad GLP-1.

La invención abarca polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de albúmina terapéuticas y proteínas de fusión de albúmina terapéuticas.

La seroalbúmina humana (HSA o HA) , una proteína de 585 aminoácidos en su forma madura (como se muestra en la Figura 1 ( (SEC ID Nº 1038) ) , es responsable de una proporción significativa de la presión osmótica de suero y también funciona como vehículo de ligandos endógenos y exógenos. En la actualidad, la HA para uso clínico se produce mediante extracción de sangre humana. La producción de HA recombinante (rHA) en microorganismos se ha divulgado en los documentos EP 330 451 y EP 361 991.

Las proteínas terapéuticas en su estado nativo o cuando se producen de forma recombinante, tales como interferones y hormonas de crecimiento, normalmente son moléculas lábiles que exhiben semividas cortas, en particular cuando se formulan en soluciones acuosas. La inestabilidad en estas moléculas cuando se formulan para administración dicta que muchas de las moléculas se deben liofilizar y refrigerar en todo momento durante el almacenamiento, de modo que hace que las moléculas sean difíciles de transportar y/o almacenar. Los problemas de almacenamiento son particularmente agudos cuando las formulaciones farmacéuticas se deben almacenar y dispensar fuera del entorno hospitalario.

El documento WO 00/69911 divulga el péptido similar a la hormoma peptídica insulinotrópica glucagón (GLP-1) que se ha unido covalentemente a la albúmina, con el fin de incrementar la semivida del GLP-1. El documento WO 01/79258 divulga múltiples copias de un polinucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende albúmina y una proteína terapéutica con el fin de estabilizar y prolongar la semivida de la proteína terapéutica. Estos polinucleótidos se han integrado en el genoma.

Se han propuesto pocas soluciones prácticas a los problemas de almacenamiento de las moléculas proteicas lábiles. De acuerdo con lo anterior, existe la necesidad de formulaciones de larga duración estabilizadas de moléculas terapéuticas proteináceas que se dispensan fácilmente, preferentemente con una sencilla formulación que requiere una mínima manipulación posterior a la conservación.

Sumario de la invención 1. Una proteína de fusión de la albúmina que comprende dos o más polipéptidos de GLP-1 orientados en tándem, en la que (i) dichos polipéptidos GLP-1 se seleccionan de 2 5

(a) GLP-1 silvestre;

(b) Gap-1 (9-36) ;

(c) GLP-1 (7-36) ;

(d) GLP-1 (7-36 (A8G) ) ;

(e) OLP-1 (7-36 (A8S) ) ; y

(f) otros fragmentos de GLP-1 y/o variantes de GLP-1, que tienen actividad de GLP-1;

condensados con albúmina, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1038, un fragmento de albúmina, o variante de albúmina de la misma,

(ii) dicho fragmento de albúmina o variante de albúmina aumenta la semivida plasmática en suero de los polipéptidos GLP-1 y

(iii) dicha proteína de fusión tiene actividad GLP-1.

2. Un polinucleótido que codifica la proteína de fusión de la albúmina de la invención.

3. Un vector que comprende el polinucleótido que codifica la proteína de fusión de la albúmina de la invención.

4. Un procedimiento para producir una proteína de fusión de albúmina, que comprende

(a) transformar una célula huésped que comprende al menos un vector que comprende el polinucleótido que codifica la proteína de fusión de la albúmina de la invención;

(b) cultivar la célula huésped en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de fusión de la albúmina; y

(c) aislar la proteína de fusión de la albúmina.

5. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de la albúmina de la invención.

6. La proteína albúmina de la invención para usar como medicamento.

7. La proteína de fusión de la albúmina de la invención para usar en el tratamiento de la hiperglucemia, la diabetes, la diabetes insípida, la diabetes mellitus; la diabetes de tipo 1, la diabetes de tipo 2; la resistencia a la insulina; la deficiencia de insulina, la hiperlipidemia, la hipercetonemia, la diabetes mellitus no dependiente de insulina (DMNDI) , la diabetes mellitus dependiente de insulina (DMDI) , la obesidad, la retinopatía, las úlceras, la supresión del peso corporal, la supresión del apetito, el síndrome X, trastornos metabólicos, inmunitarios y vasculares asociadas a la diabetes y trastornos cardiovasculares.

8. El uso de la proteína de fusión de la albúmina de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la hiperglucemia, la diabetes, la diabetes insípida, la diabetes mellitus; la diabetes de tipo 1, la diabetes de tipo 2; la resistencia a la insulina; la deficiencia de insulina, la hiperlipidemia, la hipercetonemia, la diabetes mellitus no dependiente de insulina (DMNDI) , la diabetes mellitus dependiente de insulina (DMDI) , la obesidad, la retinopatía, las úlceras, la supresión del peso corporal, la supresión del apetito, el síndrome X, trastornos metabólicos, inmunitarios y vasculares asociadas a la diabetes y trastornos cardiovasculares.

En un aspecto preferido de la invención, las proteínas de fusión de la albúmina incluyen, entre otras, aquellas construcciones de GLP-1 codificadas por los polinucleótidos descritos en la Tabla 2.

La divulgación también abarca formulaciones farmacéuticas que comprenden una proteína de fusión de la albúmina de la invención y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas formulaciones pueden estar en un kit

o contenedor. Dicho kit o contenedor puede estar envasado con instrucciones pertenecientes a la semivida prolongada de la proteína terapéutica. Dichas formulaciones se pueden usar en el tratamiento, prevención, mejora o diagnóstico de una enfermedad o síntomas de enfermedades en un paciente, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano, que comprende la etapa de administrar la formulación farmacéutica al paciente.

En otras realizaciones, la presente divulgación abarca procedimientos de prevención, creación o alivio de una enfermedad o trastorno. La presente invención abarca un procedimiento de tratar una enfermedad o trastorno indicado en la columna “Indicación preferida: Y” de la Tabla 1 que comprende administrar a un paciente en el que se desea dicho tratamiento, prevención o mejora una proteína de fusión de la albúmina de la invención que comprende GLP-1 o una porción correspondiente a un fragmento de GLP-1 o variante del mismo divulgado en a columna de “Proteína terapéutica: X" (en el GLP-1 del presente caso) de la Tabla 1 (en la misma fila que la enfermedad o trastorno que se va a tratar se indica en la columna "Indicación preferida: Y" de la Tabla 1) en una cantidad eficaz para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad o trastorno.

En una realización, una proteína de fusión de la albúmina de acuerdo con la invención tiene una semivida 5 prolongada.

En una segunda realización, una proteína de fusión de la albúmina de acuerdo con la invención es más estable que la correspondiente molécula de GLP-1 sin condensar descrita en la Tabla 1.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1A-D muestra la secuencia de aminoácidos de la forma madura de la albúmina humana (SEC ID Nº 1038) 10 y un polinucleótido que la codifica (SEC ID Nº 1037) .

La Figura 2 muestra el mapa de restricción del vector de clonación pPPC0005 depositado en la ATCC como PTA3278.

La Figura 3 muestra el mapa de restricción del vector de expresión en levaduras S. cerevisiae pSAC35 (Sleep y col., BioTechnology 8:42 (1990) ) .

La Figura 4 muestra... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de fusión de la albúmina que comprende dos o más polipéptidos de GLP-1 orientados en tándem, en la que

(i) dichos polipéptidos GLP-1 se seleccionan de

(a) GLP-1 de tipo silvestre;

(b) GLP-1 (9-36) ;

(c) GLP-1 (7-36) ;

(d) GLP-1 (7-36 (A8G) ) ;

(e) GLP-1 (7-36 (A8S) ) ; y

(f) otros fragmentos de GLP-1 y/o variantes de GLP-1 que tienen actividad de GLP-1, fusionados a albúmina, que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1038, un fragmento de albúmina, o variante de albúmina de la misma,

(ii) dicho fragmento de albúmina o variante de albúmina aumenta la semivida plasmática en suero de los polipéptidos GLP-1 y

(iii) dicha proteína de fusión tiene actividad GLP-1.

2. La proteína de fusión de albúmina de la reivindicación 1, en la que dichos polipéptidos de GLP-1 orientados en tándem se seleccionan de

(i) al menos una secuencia de GLP-1 de tipo silvestre fusionada con al menos una secuencia del fragmento de GLP-1 que tiene actividad de GLP-1;

(ii) al menos una secuencia de GLP-1 de tipo silvestre fusionada con al menos una secuencia de la variante de GLP-1 que tiene actividad de GLP-1; y

(iii) al menos una secuencia del fragmento de GLP-1 fusionada con al menos una secuencia de la variante de GLP-1 que tiene actividad de GLP-1.

3. La proteína de fusión de albúmina de la reivindicación 1, en la que dichos polipéptidos de GLP-1 orientados en tándem se seleccionan dos GLP-1 (7-36 (A8G) ) orientados en tándem.

4. La proteína de fusión de albúmina de la reivindicación 1, en donde dicha proteína de fusión de albúmina se produce en una célula huésped que comprende una construcción que expresa dicha proteína de fusión de albúmina, en donde dicha construcción se selecciona de las construcciones siguientes como se define en la tabla 2.

(a) construcción ID 2900;

(b) construcción ID 2964;

(c) construcción ID 2803;

(d) construcción ID 2804;

(e) construcción ID 2945;

(f) construcción ID 2982;

(g) construcción ID 3070;

(h) construcción ID 3027;

(i) construcción ID 3028;

(j) construcción ID 3045;

(k) construcción ID 3046;

(l) construcción ID 3069;

(m) construcción ID 3071;

(n) construcción ID 3072;

(o) construcción ID 3085;

(p) construcción ID 3086;

(q) construcción ID 3087;

(r) construcción ID 3309; y

(s) construcción ID 2904;

5. La proteína de fusión de albúmina de la reivindicación 1, en donde dicha proteína de fusión de albúmina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de

(a) los aminoácidos 1 a 30 de SEC ID Nº 1808,

(b) los aminoácidos 100 a 127 de SEC ID Nº 1249; y

(c) los aminoácidos 98 a 127 de SEC ID Nº 630; en donde dicha proteína de fusión tiene actividad GLP-1.

6. La proteína de fusión de albúmina de la reivindicación 5, en la que dichos polipéptidos de GLP-1 comprenden

(i) al menos dos secuencias de aminoácidos de (a) ;

(ii) al menos dos secuencias de aminoácidos de (b) ;

(iii) al menos dos secuencias de aminoácidos de (c) ;

(iv) al menos una secuencia de aminoácidos de (b) y al menos una secuencia de aminoácidos de (c) ; o

(v) al menos una secuencia de aminoácidos de (a) y al menos una secuencia de aminoácidos de (c) .

7. La proteína de fusión de albúmina de la reivindicación 1, en donde dicha proteína de fusión de albúmina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) los aminoácidos 25 a 669 de SEC ID Nº 1231;

(b) los aminoácidos 25 a 669 de SEC ID Nº 1232;

(c) los aminoácidos 25 a 669 de SEC ID Nº 1233;

(d) los aminoácidos 25 a 667 de SEC ID Nº 1234;

(e) los aminoácidos 25 a 669 de SEC ID Nº 1235;

(f) los aminoácidos 25 a 669 de SEC ID Nº 1236;

(g) los aminoácidos 25 a 667 de SEC ID Nº 1237;

(h) los aminoácidos 30 a 674 de SEC ID Nº 1280;

(i) los aminoácidos 20 a 664 de SEC ID Nº 1607;

(j) los aminoácidos 20 a 664 de SEC ID Nº 1608;

(k) los aminoácidos 19 a 663 de SEC ID Nº 1609;

(l) los aminoácidos 19 a 663 de SEC ID Nº 1610;

(m) los aminoácidos 24 a 668 de SEC ID Nº 1621;

(n) los aminoácidos 87 a 730 de SEC ID Nº 1622;

(o) los aminoácidos 18 a 662 de SEC ID Nº 1623;

(p) los aminoácidos 87 a 730 de SEC ID Nº 1624;

(q) los aminoácidos 24 a 668 de SEC ID Nº 1625;

(r) los aminoácidos 18 a 662 de SEC ID Nº 1626; y

(s) los aminoácidos 30 a 673 de SEC ID Nº 2170; en donde dicha proteína de fusión tiene actividad GLP-1.

8. La proteína de fusión de albúmina de la reivindicación 1, en donde dicha proteína de fusión se produce en una célula huésped que comprende la secuencia de aminoácidos de la construcción 3070 contenida en la ATCC con el depósito número PTA-4671.

9. La proteína de fusión de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dichos polipéptidos de GLP-1 se fusionan en el extremo N o en el extremo C con albúmina.

10. La proteína de fusión de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha proteína de fusión de albúmina está glicosilada o no glicosilada.

11. La proteína de fusión de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha proteína de fusión de albúmina se expresa en levaduras.

12. La proteína de fusión de albúmina de la reivindicación 11, en la que dicha levadura es S. cerevisiae, K. lactis o P. pastoris

13. La proteína de fusión de albúmina de la reivindicación 11 o 12, en la que dicha levadura es deficiente en glicosilación.

14. La proteína de fusión de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en la que dicha levadura es deficiente en glicosilación y en proteasa.

15. La proteína de fusión de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha proteína de fusión de albúmina se expresa en una célula de mamífero.

16. La proteína de fusión de albúmina de la reivindicación 15, en donde dicha célula de mamífero es una célula CHO, una célula COS o una célula NSO.

17. La proteína de fusión de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde dicha proteína de fusión de albúmina comprende además una secuencia líder de secreción.

18. La proteína de fusión de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde dicha proteína de fusión de albúmina se formula con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. Un polinucleótido que codifica la proteína de fusión de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

20. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 19.

21. Un procedimiento para producir una proteína de fusión de albúmina, que comprende

(a) transformar una célula huésped que comprende al menos un vector de la reivindicación 20.

(b) cultivar la célula huésped en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de fusión de la albúmina; y

(c) aislar la proteína de fusión de la albúmina.

22. Una composición farmacéutica, que comprende la proteína de fusión de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

23. La proteína de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para usar como medicamento.

24. La proteína de fusión de la albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, para usar en el tratamiento de hiperglucemia, diabetes, diabetes insípida, diabetes mellitus; diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina, hiperlipidemia, hipercetonemia, diabetes mellitus no dependiente de insulina (DMNDI) , diabetes mellitus dependiente de insulina (DMDI) , obesidad, retinopatía, las úlceras, supresión del peso corporal, supresión del apetito, el síndrome X, trastornos metabólicos, inmunitarios y vasculares asociadas a la diabetes y trastornos cardiovasculares.

25. Uso de la proteína de fusión de la albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, para la fabricación de un medicamento para tratar hiperglucemia, diabetes, diabetes insípida, diabetes mellitus; diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina, hiperlipidemia, hipercetonemia, diabetes mellitus no dependiente de insulina (DMNDI) , diabetes mellitus dependiente de insulina (DMDI) , obesidad, retinopatía, las úlceras, supresión del peso corporal, supresión del apetito, el síndrome X, trastornos metabólicos, inmunitarios y

vasculares asociados a la diabetes y trastornos cardiovasculares.

26. La proteína de fusión de la reivindicación 24 o el uso de la reivindicación 25, en donde el trastorno es diabetes de tipo 2.

27. La proteína de fusión de la reivindicación 24 o el uso de la reivindicación 25, en donde dicho trastorno cardiovascular se selecciona del grupo que consiste en fístula arterio-arterial, fístula arteriovenosa, malformaciones arteriovenosas cerebrales, defectos cardíacos congénitos, atresia pulmonar y síndrome de la cimitarra.

28. La proteína de fusión o el uso de la reivindicación 27, en donde dicho defecto cardíaco congénito se selecciona del grupo que consiste en coartación aórtica, cor triatriatum, anomalías de los vasos coronarios, corazón entrecruzado, dextrocardia, conducto arterial persistente, anomalía de Ebstein, complejo de Eisenmenger, síndrome del corazón izquierdo hipoplásico, levocardia, tetralogía de Fallot, transposición de grandes vasos, doble salida del ventrículo derecho, atresia de la tricúspide, tronco arterial persistente y defectos septales cardíacos, tales como defecto septal aortopulmonar, defectos de la almohadilla endocárdica, síndrome de Lutembacher, trilogía de Fallot y defectos septales cardíacos ventriculares.

29. La proteína de fusión de la reivindicación 24 o el uso de la reivindicación 25, en donde dicho trastorno cardiovascular se selecciona del grupo que consiste en enfermedad cardíaca, arritmias, enfermedad cardíaca carcinoide, gasto cardíaco elevado, gasto cardíaco bajo, taponamiento cardíaco, endocarditis, aneurisma cardíaco, parada cardíaca, insuficiencia cardíaca congestiva, disnea paroxística, edema cardíaco, hipertrofia cardíaca, miocardiopatía congestiva, hipertrofia del ventrículo izquierdo, hipertrofia del ventrículo derecho, rotura cardíaca postinfarto, rotura del tabique ventricular, enfermedades de las válvulas cardíacas, enfermedades del miocardio, isquemia miocárdica, derrame pericárdico, pericarditis, neumopericardio, síndrome pospericardiotomía, enfermedad cardíaca pulmonar, enfermedad cardíaca reumática, disfunción ventricular, hiperemia, complicaciones cardiovasculares de la gestación, síndrome de la cimitarra, sífilis cardiovascular y tuberculosis cardiovascular.

30. La proteína de fusión o el uso de la reivindicación 29, en donde dicha arritmia se selecciona del grupo que consiste en arritmia sinusal, fibrilación auricular, aleteo auricular, bradicardia, extrasístole, síndrome de Adams-Stokes, bloqueo de rama, bloqueo senoauricular, síndrome del QT largo, parasístole, síndrome de Lown-Ganong-Levine, síndrome de preexcitación de tipo Mahaim, síndrome de Wolff-Parkinson-White, síndrome del seno enfermo, taquicardias y fibrilación ventricular.

31. La proteína de fusión o el uso de la reivindicación 30, en donde dicha taquicardia se selecciona del grupo que consiste en taquicardia paroxística, taquicardia supraventricular, ritmo idioventricular acelerado, taquicardia de reentrada nodal auriculoventricular, taquicardia auricular ectópica, taquicardia ectópica de la unión, taquicardia de reentrada nodal senoauricular, taquicardia sinusal, Torsades de Pointes y taquicardia ventricular.

32. La proteína de fusión o el uso de la reivindicación 29, en donde dicha enfermedad de válvula cardíaca se selecciona del grupo que consiste en insuficiencia de la válvula aórtica, estenosis de la válvula aórtica, soplos cardíacos, prolapso de la válvula aórtica, prolapso de la válvula mitral, prolapso de la válvula tricúspide, insuficiencia de la válvula mitral, estenosis de la válvula mitral, atresia pulmonar, insuficiencia de la válvula pulmonar, estenosis de la válvula pulmonar, atresia de la tricúspide, insuficiencia de la válvula tricúspide y estenosis de la válvula tricúspide.

33. La proteína de fusión o el uso de la reivindicación 29, en donde dicha enfermedad miocárdica se selecciona del grupo que consiste en miocardiopatía alcohólica, miocardiopatía congestiva, miocardiopatía hipetrófica, estenosis subvalvular aórtica, estenosis subvalvular pulmonar, miocardiopatía restrictiva, miocardiopatía de Chagas, fibroelastosis endocárdica, fibrosis endomiocárdica, síndrome de Kearns, lesión por reperfusión del miocardio y miocarditis.

34. La proteína de fusión o el uso de la reivindicación 29, en donde dicha isquemia miocárdica se selecciona del grupo que consiste en enfermedad coronaria, angina de pecho, aneurisma coronario, arteriosclerosis coronaria, trombosis coronaria, vasoespasmo coronario, infarto de miocardio, aturdimiento miocárdico.

35. La proteína de fusión de la reivindicación 24 o el uso de la reivindicación 25, en donde dicho trastorno cardiovascular se selecciona del grupo que consiste en aneurismas, angiodisplasia, angiomatosis, angiomatosis bacilar, enfermedad de Hippel-Lindau, síndrome de Klippel-Trenaunay-Weber, síndrome de Sturge-Weber, edema angioneurótico, enfermedades aórticas, arteritis de Takayasu, aortitis, síndrome de Leriche, enfermedades oclusivas arteriales, arteritis, enarteritis, poliarteritis nodosa, trastornos cerebrovasculares, angiopatías diabéticas, retinopatía diabética, embolias, trombosis, eritromegalgia, hemorroides, enfermedad venooclusiva hepática, hipertensión, hipotensión, isquemia, enfermedades vasculares periféricas, flebitis, enfermedad venooclusiva pulmonar, enfermedad de Raynaud, síndrome de CREST, oclusión de la vena retiniana, síndrome de la cimitarra, síndrome de la vena cava superior, telangiectasia, telangiectasia ataxia, telangiectasia hemorrágica hereditaria, varicocele, venas varicosas, úlcera varicosa, vasculitis e insuficiencia venosa.