Anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a los receptores de TRAIL.

Un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende:

(a) la secuencia de aminoácidos del dominio VH de SEC ID Nº 43 o la secuencia de aminoácidos del dominio VH expresado por el hibridoma de nº de depósito en la ATCC PTA-3570,

y

(b) la secuencia de aminoácidos del dominio VL de SEC ID Nº 43 o la secuencia de aminoácidos del dominio VL expresado por el hibridoma de nº de depósito en la ATCC PTA-3570,

en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespecíficamente a TR4.

Anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a los receptores de TRAIL

Campo de la invención La presente divulgación se refiere a anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen inmunoespecíficamente al receptor de TRAIL TR4. Estos anticuerpos tienen usos en, por ejemplo, la prevención y el tratamiento de cánceres y de otros trastornos proliferativos. La divulgación también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-TR4, vectores y células huésped que contienen estos ácidos nucleicos. La presente invención se refiere a la prevención, detección, diagnóstico, tratamiento o mejora de una enfermedad o trastorno, especialmente cáncer y otros trastornos hiperproliferativos, en un animal, preferentemente un ser humano, usando uno o más anticuerpos o fragmentos que se unen inmunoespecíficamente a TR4.

Antecedentes de la invención Muchas acciones biológicas, por ejemplo la respuesta a determinados estímulos y procesos biológicos naturales, están controladas por factores, tales como citocinas. Muchas citocinas actúan a través de receptores uniéndose al receptor y produciendo una respuesta intracelular.

Por ejemplo, los factores de necrosis tumoral (TNF) alfa y beta son citocinas que actúan a través de los receptores del TNF y regulan numerosos procesos biológicos, incluida la protección contra infecciones y la inducción del shock

y la enfermedad inflamatoria. Las moléculas de TNF pertenecen a la superfamilia de los “ligandos del TNF” y actúan junto con sus receptores o contraligandos, la superfamilia de los “receptores del TNF”. Hasta ahora se han identificado al menos dieciocho miembros de la superfamilia de los ligandos del TNF y se han caracterizado al menos diecinueve miembros de la superfamilia de los receptores del TNF (véase, p. ej., Locksley y col., Cell (2001) 104:487-501) .

Entre los ligandos se incluyen TNF-α, linfotoxina-α (LT-α, también conocido como TNF-β) , LT-β (que se encuentra en un complejo heterotrimérico LT-α2-β) , FasL, CD40L, CD27L, CD30L, 4-lBBL, OX40L y el factor de crecimiento neural (NGF) . La superfamilia de los receptores del TNF incluye el receptor de p55TNF, el receptor de p75TNF, la proteína relacionada con el receptor de TNF, antígeno FAS o APO-1, CD40, CD27, CD30, 4-lBB, OX40, p75 de baja afinidad y receptor de NGF (Meager, A., Biologicals, 22:291-295 (1994) ) .

Muchos miembros de la superfamilia de los ligandos del TNF se expresan en linfocitos T activados, lo que implica que son necesarios para las interacciones de los linfocitos T con otros tipos celulares subyacentes a la ontogenia y las funciones celulares. (Meager, A., anteriormente) .

Se ha obtenido bastante información sobre las funciones esenciales de varios miembros de la familia de los receptores del TNF a partir de la identificación y creación de mutantes que anulan la expresión de estas proteínas. Por ejemplo, las mutaciones de origen natural del antígeno FAS y su ligando producen enfermedades linfoproliferativas (Watanabe-Fukunaga, R., y col., Nature 356:314 (1992) ) , lo que quizá refleje un falo de la muerte celular programada. Las mutaciones del ligando de CD40 producen un estado de inmunodeficiencia ligado al cromosoma X caracterizado por niveles elevados de inmunoglobulina M y niveles bajos de inmunoglobulina G en plasma, lo que indica un fallo de la activación de linfocitos B dependiente de linfocitos T (Allen, R.C. y col., Science 259:990 (1993) ) . Las mutaciones dirigidas del receptor del factor de crecimiento neural de baja afinidad producen un trastorno caracterizado por un fallo en la innovación de estructuras periféricas (Lee, K.F. y col. Cell 69:737 (1992) ) .

TNF y LT-α se pueden unir a dos receptores del TNF (los receptores del TNF de 55- y 75 kd) . Un gran número de efectos biológicos producidos por TNF y LT-α, que actúan a través de sus receptores, incluyen necrosis hemorrágica de tumores transplantados, citotoxicidad, un papel en el shock endotóxico, inflamación, inmunorregulación, proliferación y respuestas antivirales, así como protección contra los efectos perjudiciales de la radiación ionizante El TNF y el LT-α están implicados en la patogenia de un amplio abanico de enfermedades, incluidos shock endotóxico, malaria cerebral, tumores, enfermedad autoinmunitaria, SIDA y rechazo del injerto en el huésped (Beutler, B. y Von Huffel, C., Science 264:667-668 (1994) ) . Las mutaciones en el receptor de p55 producen un incremento en la susceptibilidad a la infección microbiana.

Además, se notificó un dominio de aproximadamente 80 aminoácidos cerca del extremo C de TNFR1 (p55) y Fas como el “dominio de muerte”, que es responsable de la transducción de las señales para la muerte celular programada (Tartaglia y col., Cell 74:845 (1993) ) .

La apoptosis, o muerte celular programada, es un proceso fisiológico esencial para el desarrollo normal y la homeostasis de organismos multicelulares (H. Steller, Science 267, 1445-1449 (1995) ) . Los desarreglos de la apoptosis contribuyen a la patogenia de varias enfermedades humanas, incluyendo el cáncer, trastornos neurodegenerativos y síndrome de deficiencia humana adquirida (C.B. Thompson, Science 267, 1456-1462 (1995) ) . Recientemente, se ha centrado mucha atención sobre la transducción de la señal y la función biológica de dos receptores de superficie de la muerte celular, Fas/APO-1 y TNFR-1 (J.L. Cleveland, y col., Cell 81, 479-482 (1995) ;

A. Fraser, y col., Cell 85, 781-784 (1996) ; S. Nagata, y col., Science 267, 1449-56 (1995) ) . Ambos son miembros de la familia del receptor del TNF, que también incluyen TNFR-2, NGFR de baja afinidad, CD40, y CD30, entre otros

(C.A. Smith, y col., Science 248, 1019-23 (1990) ; M. Tewari, y col., en Modular Texts in Molecular and Cell Biology

M. Purton, Heldin, Carl, Ed. (Chapman and Hall, London, 1995) . Aunque los miembros de la familia se definen por la presencia de repeticiones ricas en cisteína en sus dominios extracelulares, Fas/APO-1 y TNFR-1 también comparten una región de homología intracelular, designada adecuadamente el "dominio de muerte", que está relacionado de forma distante con el gen suicida de Drosophila, reaper (P. Golstein, y col., Cell 81, 185-6 (1995) ; K. White y col., Science 264, 677-83 (1994) ) . Este dominio de muerte compartido sugiere que ambos receptores interaccionan con un conjunto relacionada de moléculas transductoras de la señal que, hasta recientemente, permanecían sin identificar. La activación de Fas/APO-1 recluta la molécula adaptadora que contiene el dominio de muerte FADD/MORT1 (A.M. Chinnaiyan, y col., Cell 81, 505-12 (1995) ; M. P. Boldin, y col., , J. Biol Chem 270, 7795-8 (1995) ; F.C. Kischkel, y col., , EMBO 14, 5579-5588 (1995) ) , que a su vez se une y posiblemente activa FLICE/MACH1, un miembro de la familia ICE/CED-3 de proteasas proapoptóticas (M. Muzio y col., Cell 85, 817-827 (1996) ; M.P. Boldin, y col., , Cell 85, 803-815 (1996) ) . Aunque el papel central de Fas/APO-1 es desencadenar la muerte celular, el TNFR-1 puede señalar una matriz de diversas actividades biológicas muchas de las cuales surgen de su capacidad para activar NF-kB (L.A. Tartaglia, y col., , Immunol Today 13, 151-3 (1992) ) . De acuerdo con esto, TNFR-1 recluta la molécula adaptadora multivalente TRADD, que como FADD, también contiene un dominio de muerte (H. Hsu, y col., , Cell 81, 495-504 (1995) ; H. Hsu, y col., , Cell 84, 299-308 (1996) ) Mediante su asociación con una serie de moléculas de señalización, incluidas FADD, , TRAF2 y RIP, TRADD puede señalizar la apoptosis y la activación de NF-kB (H. Hsu, y col., Cell 84, 299-308 (1996) ; H. Hsu, y col., Immunity 4, 387-396 (1996) ) .

Varios grupos han notificado un ligando inductor de la apoptosis relacionada con el TNF y se ha denominado Molécula inductora de la apoptosis I (AIM-I) (solicitud internacional Nº WO 97/33899) y ligando inductor de la apoptosis relacionado con el TNF o (TRAIL) (Wiley, S.R. y col., Immunity 3:673-682 (1995) ) . Pitti, R.M. y col., hacen referencia a la nueva molécula como ligando Apo-2 o ("Apo-2L") . Por comodidad, en el presente documento se denominará TRAIL. La secuencia de aminoácidos de TRAIL se proporciona en la SEC ID Nº: 66.

Al contrario que el ligando de FAS, cuyos transcritos parecen estar considerablemente restringidos a los linfocitos T estimulados, en muchos tejidos se ven niveles significativos de TRAIL, transcrito constitutivamente en algunas líneas celulares. Se ha demostrado que TRAIL actúa de forma independiente del ligando FAS (Wiley, S.R., y col., (1995) ) , ant) . Los estudios realizados por Marsters, S.A. y col., han indicado qye TRAIL activa la apoptosis... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende:

(a) la secuencia de aminoácidos del dominio VH de SEC ID Nº 43 o la secuencia de aminoácidos del dominio VH expresado por el hibridoma de nº de depósito en la ATCC PTA-3570, y

(b) la secuencia de aminoácidos del dominio VL de SEC ID Nº 43 o la secuencia de aminoácidos del dominio VL expresado por el hibridoma de nº de depósito en la ATCC PTA-3570,

en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespecíficamente a TR4.

2. Un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende:

(a) la secuencia de aminoácidos de las 3 CDR de VH de SEC ID Nº 43 o la secuencia de aminoácidos de las 3 CDR de VH expresadas por el hibridoma de nº de depósito en la ATCC PTA-3570, y

(b) la secuencia de aminoácidos de las 3 CDR de VL de SEC ID Nº 43 o la secuencia de aminoácidos de las 3 CDR de VL expresadas por el hibridoma de nº de depósito en la ATCC PTA-3570, y

en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespecíficamente a TR4.

3. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 1 o 2, que se une a TR4 expresado sobre la superficie de una célula.

4. El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo está seleccionado del grupo que consiste en:

(a) una molécula de inmunoglobulina entera,

(b) un scFv;

(c) un anticuerpo monoclonal;

(d) un anticuerpo humano;

(e) un anticuerpo quimérico;

(f) un anticuerpo humanizado;

(g) un fragmento Fab;

(h) un fragmento Fab';

(i) un F (ab') 2;

(j) un Fv; y

(k) un Fv unido por puentes disulfuro.

5. El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende un dominio constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un dominio constante de IgM humana;

(b) un dominio constante de IgG humana; y

(c) un dominio constante de IgA humana.

6. El anticuerpo de la reivindicación 5, en el que el dominio constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina es un dominio constante de IgG1, un dominio constante de IgG2, un dominio constante de IgG3 o un dominio constante de IgG4.

7. El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende un dominio constante de la cadena ligera de la inmunoglobulina seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un dominio constante kappa humano; y

(b) un dominio constante lambda humano.

8. Un anticuerpo expresado por la línea celular de la ATCC con depósito PTA-3570.

9. Una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10, Un vector que comprende la molécula ácido nucleico de la reivindicación 9.

11. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 10 o la molécula ácido nucleico de la reivindicación 9.

12. Una línea celular modificada por ingeniería para expresar el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

13. La línea celular de la reivindicación 12, en la que las células son células NSO o células CHO.

14. Un anticuerpo que se puede obtener mediante expresión de la línea celular de la reivindicación 12 o 13.

15. Un procedimiento para fabricar un anticuerpo, que comprende:

(a) expresar el anticuerpo codificado por la molécula ácido nucleico de la reivindicación 9; y

(b) recuperar dicho anticuerpo.

16. Un anticuerpo obtenible mediante el procedimiento de la reivindicación 15.

17. El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 14 y 16. en el que el anticuerpo o fragmento del mismo tiene una constante de disociación (KD) inferior o igual a 10-9 M.

18. El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 14, 16 y 17 en el que el anticuerpo o fragmento del mismo está marcado.

19. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 18, que está marcado con un radiomarcador.

20, El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 19, en el que el radiomarcador es 125I, 131I, 111In, 90Y, 99Tc, 177Lu, 166Ho, o 153Sm.

21. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 18, que está marcado con una enzima, un marcador fluorescente, un marcador luminiscente o un marcador bioluminiscente.

22. El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 14, 16 y 17 en el que el anticuerpo o fragmento del mismo está biotinilado.

23. El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 14, 16 y 17 en el que el anticuerpo o fragmento del mismo está conjugado con un agente terapéutico o citotóxico.

24. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 23, en el que el agente terapéutico o citotóxico está seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un antimetabolito;

(b) un agente alquilante;

(c) un antibiótico;

(d) un factor de crecimiento;

(e) una citocina;

(f) un agente antiangiogénico;

(g) un agente antimitótico;

(h) una antraciclina;

(i) toxina; y

(j) un agente apoptótico.

25. El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 14 y 16 a 24 en el que el anticuerpo o fragmento del mismo está unido a un soporte sólido.

26. El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 14 y 16 a 25 en el que el anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespecíficamente a TR4 en una transferencia Western o

en un ELISA.

27. Una célula que produce el anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 14, 16 y 17.

28. El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 14 y 16 a 26 que inhibe la capacidad de TRAIL para unirse a TR4.

29. El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 14, 16 a 26 y 28, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo es un agonista de TR4.

30, El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 14, 16 a 26 y 28 a 29, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo estimula la apoptosis de las células que expresan TR4.

31. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 30, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo estimula la apoptosis de las células que expresan TR4.

(a) mejor que una concentración igual del polipéptido TRAIL estimula la apoptosis de las células que expresan TR4; o

(b) igual de bien en presencia o ausencia de reactivos de reticulación del anticuerpo.

32. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 30 o 31, en el anticuerpo o fragmento del mismo no es hepatotóxico.

33. El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 14, 16 a 26, 28 a 30 y 31, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo regula por aumento la expresión del receptor de TRAIL.

34. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 14, 16 a 26 y 28 a 33.

35. El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 14, 16 a 26 y 28 a 29 y 30 a 33 para su uso en un procedimiento de tratamiento, prevención o mejora de un cáncer, en el que el procedimiento comprende administrar dicho anticuerpo o fragmento del mismo a un animal.

36. El anticuerpo de la reivindicación 35 o fragmento del mismo para el uso de la reivindicación 35 en el que el animal es un ser humano.

37. El anticuerpo de la reivindicación 35 o fragmento del mismo para el uso de la reivindicación 35 o 36, en el que el cáncer es cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de útero, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer gastrointestinal, cáncer de hígado, sarcoma de Kaposi o mieloma múltiple.

38. El anticuerpo de la reivindicación 35 o fragmento del mismo para el uso de la reivindicación 35 o 36, en el que el cáncer es un cáncer del sistema nervioso central.

39. El anticuerpo de la reivindicación 35 o fragmento del mismo para el uso de la reivindicación 38, en el que el cáncer del sistema nervioso central es un meduloblastoma, un neuroblastoma o un glioblastoma.

40, El anticuerpo de la reivindicación 35 o fragmento del mismo para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 39, en el que el procedimiento comprende administrar el anticuerpo o fragmento del mismo en combinación con un agente quimioterapéutico.

41. El anticuerpo de la reivindicación 35 o fragmento del mismo para el uso de la reivindicación 40, en el que el agente quimioterapéutico está seleccionado del grupo que consiste en:

(a) irinotecán;

(b) paclitaxel (TAXOL) ®; y

(c) gemcitabina.

42. El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 14, 16 a 26, 28 a 29 y 30 a 33 para su uso en un procedimiento de inhibición del crecimiento, o muerte, de las células que expresan TR4, en el que dicho procedimiento comprende administrar el anticuerpo o fragmento del mismo a un animal en el que se desee dicha inhibición del crecimiento o muerte de las células que expresan el receptor TR4..

43. Un procedimiento detectar la expresión de un polipéptido de TR4, que comprende:

(a) analizar la expresión de un polipéptido de TR4 en una muestra biológica de un individuo que usa el

anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 14, 16 a 26 y 28 a 33; y

(b) comparar el nivel de un polipéptido de TR4 con un nivel estándar de un polipéptido del receptor de TRAIL.

44. Un procedimiento para detectar, diagnosticar, ofrecer un pronóstico o vigilar cánceres y otros trastornos hiperproliferativos, que comprende:

(a) analizar la expresión de un polipéptido de TR4 en una muestra biológica de un individuo que usa el anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 14, 16 a 26 y 28 a 33; y

(b) comparar el nivel de un polipéptido de TR4 con un nivel estándar de un polipéptido de TR4.

45. Un kit que comprende anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 14, 16 a 28 y 28 a 33.

46. El kit de la reivindicación 45, que comprende un anticuerpo control.

47. El kit de la reivindicación 45 o 46, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo está acoplado a, o 15 conjugado con, un marcador detectable.