Proteínas de fusión de albúmina y GCSF.

Una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia líder y una proteína de fusión de albúmina que comprende un polinucleótido que codifica una secuencia líder HSA (seroalbúmina humana)/kex2,

un polinucleótido que codifica seroalbúmina humana madura, un polinucleótido que codifica un factor estimulador de colonias de granulocitos maduro (G-CSF) y una secuencia polinucleotídica que comprende una secuencia promotora, una secuencia marcadora seleccionable y una región para terminación de transcripción, en la que la secuencia líder HSA (seroalbúmina humana)/kex2 codificada está fusionada al extremo N-terminal de seroalbúmina humana madura, en la que dicha seroalbúmina humana madura está fusionada al extremo N-terminal de dicho G-CSF maduro y en la que dicha proteína de fusión de albúmina tiene actividad de G-CSF, opcionalmente en la que la molécula de ácido nucleico es parte de un casete de expresión.

Proteínas de fusión de albúmina y GCSF

Antecedentes de la invención La invención se refiere en general a proteínas terapéuticas condensadas a albúmina. La invención abarca polinucleótidos que codifican proteínas terapéuticas de fusión de albúmina, proteínas terapéuticas de fusión de albúmina, para su uso en medicina. Las células huésped transformadas con los polinucleótidos que codifican proteínas terapéuticas de fusión de albúmina también entran dentro de la invención, así como los procedimientos para fabricar las proteínas de fusión de albúmina de la invención usando estos polinucleótidos y/o células huésped.

La seroalbúmina humana (HSA o HA) , una proteína de 585 aminoácidos en su forma madura (como se muestra en la Figura 1 (SEC ID N.º: 1038) ) , es responsable de una proporción significativa de la presión osmótica del suero y también funciona como vehículo de ligandos endógenos y exógenos. En la actualidad, la HA para uso clínico se produce mediante extracción de sangre humana. La producción de HA recombinante (rHA) en microorganismos se ha divulgado en los documentos EP 330 451 y EP 361 991.

Las proteínas terapéuticas en su estado nativo o cuando se producen de forma recombinante, tales como interferones y hormonas de crecimiento, normalmente son moléculas lábiles que exhiben semividas cortas, en particular cuando se formulan en soluciones acuosas. La inestabilidad en estas moléculas cuando se formulan para administración dicta que muchas de las moléculas se deben liofilizar y refrigerar en todo momento durante el almacenamiento, de modo que hace que las moléculas sean difíciles de transportar y/o almacenar. Los problemas de almacenamiento son particularmente agudos cuando las formulaciones farmacéuticas se deben almacenar y dispensar fuera del entorno hospitalario.

Se han propuesto pocas soluciones prácticas a los problemas de almacenamiento de las moléculas proteicas lábiles. De acuerdo con lo anterior, existe la necesidad de formulaciones de larga duración estabilizadas de moléculas terapéuticas proteináceas que se dispensan fácilmente, preferentemente con una sencilla formulación que requiere una mínima manipulación posterior al almacenaje.

Sumario de la invención La expresión “una proteína terapéutica” usado en esta memoria descriptiva hace referencia a la forma madura del factor estimulante de las colonias de granulocitos (G-CSF) .

La presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia líder y una proteína de fusión de la albúmina, que comprende un polinucleótido que codifica una secuencia líder de seroalbúmina humana (HSA) /kex2, un polinucleótido que codifica la seroalbúmina humana madura, un polinucleótido que codifica un factor estimulante de las colonias de granulocitos madiro (G-CSF) y una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuenia promotora, una secuencia de marcador seleccionable y una región para la terminación de la transripción, en el que la secuencia líder de seroalbúmina humana (HSA) /kex2 está fusionada al extremo N de dicha seroalbúmina madura, en la que dicha seroalbúmina madura está fusionada al extremo N del G-CSF maduro y en el que dicha proteína de fusión de albúmina tiene actividad G-CSF. En una realización, la molécula de ácido nucleico es parte de un casete de expresión. Aditionalmente, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende el ADNc contenido en el número de depósito en la ATCC PTA-3766.

La presente invención también proporciona un vector que comprende las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente. En una realización, el vector comprende un promotor y una región de terminación asociadas operativamente a una molécula de ácido nucleico, comprendiendo la molécula de ácido nucleico la construcción contenida en el número de depósito en la ATCC, PTA-3766, en la que dicha secuencia líder es una secuencia líder HSA/kex2 híbrida que comprende los aminoácidos de la SEC ID N.º: 1111. En otra realización, el vector comprende un promotor y una región de terminación asociadas operativamente a una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia lider y una proteína de fusión de albúmina que comprende aminoácidos 1 a 783 de SEC ID N.º: 226, en la que dicha secuencia líder es una secuencia líder HSA/kex2 híbrida que comprende los aminoácidos de SEC ID N.º: 1111. En una realización, el promotor es un promotor PRB1. En una realización, el vector es un vector de expresión pSAC35.

La presente invención proporciona una célula huésped que comprende un vector según se describe anteriormente. En una realización, la célula huésped es una célula de levaduras. En otra realización, la célula de levadura es Saccharomyces cerevisiae. En aún otra realización, la célula de levadura es deficiente en glucosilación y/o deficiente en proteasas.

La presente invención también proporciona un procedimiento de producir una proteína de fusión de albúmina que comprende:

(a) cultivar una célula huésped según se describe en condiciones adecuadas para expresión de la proteína de fusión de albúmina; y

(b) aislar la proteína de fusión de albúmina.

La presente invención también proporciona una proteína de fusión albúmina-G-CSF codificada por la molécula de ácido nucleico para uso en medicina. En una realización, la proteína de fusión albúmina-G-CSF se usa en el tratamiento de trastornos inflamatorios, cáncer, leucemia, tales como leucemia mielocítica, leucemina mielógena aguda y leucemia linfoblástica aguda, neutropenia, tal como neutropenia primaria (por ejemplo síndrome de Kostmann) , neutropenia secundaria, neutropenia en pacientes infectados por el VIH y neutropenia asociada con quimioterapia, infecciones asociadas con neutropenia, mielodisplasia, enfermedades y trastornos autoinmunes, soriasis, cicatrización de heridas, linfoma, tal como linfoma no hodkiniano, enfermedad de Hodgkin o enfermedad de almacenamiento de glucógeno o para la prevención de trastornos inflamatorios, neutropenia, tal como neutropenia en pacientes infectados con VIH o neutropenia asociada con quimioterapia. En otra realización, la proteína de fusión albúmina-G-CSF codificada se puede usar en la diagnosis de enfermedades inflamatorias.

En el presente documento también se divulgan formulaciones farmacéuticas que comprenden una proteína de fusión de la albúmina de la invención y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas formulaciones pueden estar en un kit o recipiente. Dicho kit o recipiente puede estar envasado con instrucciones pertenecientes a la semivida prolongada de la proteína terapéutica. Dichas formulaciones se pueden usar en procedimientos de tratamiento, prevención, mejora o diagnóstico de una enfermedad o síntomas de enfermedades en un paciente, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano, que comprende la etapa de administrar la formulación farmacéutica al paciente.

En el presente documento también se divulgan procedimientos de prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad o trastorno. En realizaciones preferidas, la presente invención abarca proteínas de fusión de la albúmina para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno enumerado en la columna “Indicación Preferida: Y”, de la Tabla 1 que comprende administrar a un paciente en el que se desea dicho tratamiento, prevención o mejora una proteína de fusión de la albúmina de la invención que comprende una proteína terapéutica o una porción correspondiente a una proteína terapéutica (o fragmento o variante de la misma) divulgada en a columna de “Proteína terapéutica: X" de la Tabla 1 (en la misma fila que la enfermedad o trastorno que se va a tratar se indica en la columna "Indicación preferida: Y" de la Tabla 1) en una cantidad eficaz para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad o trastorno.

La proteína de fusión de la albúmina descrita en la Tabla 1 o 2 tiene una semivida ampliada.

La proteína de fusión de la albúmina descrita en la Tabla 1 o 2 es más estable que la correspondiente molécula terapéutica sin condensar descrita en la Tabla 1.

En el presente documento también se divulgan organismos transgénicos modificados para que contengan moléculas de ácido nucleico de la invención (los polinucleótidos descritos en las Tablas 1 y 2) , preferentemente, modificados para que expresen una proteína de fusión de la albúmina de la invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1A-D muestra la secuencia de aminoácidos de la forma madura de la albúmina humana (SEC ID Nº 1038) y un polinucleótido... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia líder y una proteína de fusión de albúmina que comprende un polinucleótido que codifica una secuencia líder HSA (seroalbúmina humana) /kex2, un polinucleótido que codifica seroalbúmina humana madura, un polinucleótido que codifica un factor estimulador de colonias de granulocitos maduro (G-CSF) y una secuencia polinucleotídica que comprende una secuencia promotora, una secuencia marcadora seleccionable y una región para terminación de transcripción, en la que la secuencia líder HSA (seroalbúmina humana) /kex2 codificada está fusionada al extremo N-terminal de seroalbúmina humana madura, en la que dicha seroalbúmina humana madura está fusionada al extremo N-terminal de dicho G-CSF maduro y en la que dicha proteína de fusión de albúmina tiene actividad de G-CSF, opcionalmente en la que la molécula de ácido nucleico es parte de un casete de expresión.

2. Una molécula de ácido nucleico que comprende el ADNc contenido en el número de depósito en la ATCC PTA3766.

3. Un vector que conprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2.

4. Un vector de acuerdo con la reivindicación 3 que comprende un promotor y una región de terminación asociado operativamente a una molécula de ácido nucleico, comprendiendo el ácido nucleico la construcción contenida en el número de depósito en la ATCC PTA-3766, en la que dicha secuencia líder es una secuencia líder HSA/kex2 híbrida que comprende los aminoácidos de la SEC ID N.º: 1111.

5. Un vector de acuerdo con la reivindicación 3 que comprende un promotor y una región de terminación asociados operativamente a una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia líder y una proteína de fusión de albúmina que comprende aminoácidos 1 a 783 de SEC ID N.º: 226, en el que dicha secuencia líder es una secuencia líder HSA/kex2 híbrida que comprende los aminoácidos de SEC ID N.º: 1111.

6. Un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que dicho promotor es un promotor PRB1.

7. Un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que dicho vector es un vector de expresión pSAC35.

8. Una célula huésped que comprende un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7.

9. La célula huésped de la reivindicación 8, en la que dicha célula huésped es una célua de levadura, opcionalmente en la que la célula de levadura es una Saccharomyces cerevisiae y/o en la que la célula de levadura es deficiente en glucosilación y/o en la que la célula de levadura es deficiente en proteasa.

10. Un procedimiento de producción de una proteína de fusión de albúmina que comprende:

(a) cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 8 o 9 en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de seroalbúmina bovina; y

(b) aislar la proteína de fusión de albúmina.

11. La proteína de fusión albúmina-G-CSF codificada por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en medicina.

12. La proteína de fusión albúmina-G-CSF codificada por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en el tratamiento de trastornos inflamatorios, cáncer, leucemia, tal como leucemina mielocítica, leucemia mielógena aguda y leucemia linfoblástica aguda, neutropenia, tal como neutropenia primaria (por ejemplo síndrome de Kostmann) , neutropenia secundaria, neutropenia en pacientes infectados por el VIH y neutropenia asociada con quimioterapia, infecciones asociadas con neutropenia, mielodisplasia, enfermedades y trastornos autoinmunes, soriasis, cicatrización de heridas, linfoma, tal como linfoma no de Hodgkin, enfermedad de Hodgkin o enfermedad de almacenamiento de glucógeno;

o para su uso en la prevención de trastornos inflamatorios, neutropenia, tal como neutropenia en pacientes infectados con VIH o neutropenia asociada con quimioterapia;

o para su uso en el diagnóstico de enfermedades inflamatorias.

Figura 2 Figura 3 Respuesta de células NFS-60 a proteínas de fusión de GCSF albúmina (sobrenadantes)

Sobrenadantes de proteínas de fusión de GCSF albúmina Figura 4

Efectos de proteína de fusión de GCSF albúmina (fusión de GCSF) en recuentro de glóbulos blancos totales (WBC)

Día Figura 5