Antígenos y vacunas de streptococcus pneumoniae.

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A NUEVAS VACUNAS DESTINADAS A LA PREVENCION O LUCHA CONTRA LA INFECCION POR STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE.

ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UNAS MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO QUE SE HAN AISLADO Y QUE CODIFICAN UNOS POLIPEPTIDOS ANTIGENOS DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN, POR UNA PARTE, A UNOS POLIPEPTIDOS ANTIGENOS COMO, POR EJEMPLO, VECTORES Y CELULAS HUESPEDES, Y POR OTRA PARTE, PROCEDIMIENTOS DE PRODUCCION CORRESPONDIENTES. ESTA INVENCION SE REFIERE FINALMENTE A UNAS TECNICAS DE DIAGNOSTICO QUE PERMITEN LA DETECCION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS, DE LOS POLIPEPTIDOS Y DE LOS ANTICUERPOS DE STREPTOCOCCUS EN UNA MUESTRA BIOLOGICA.

Antígenos y vacunas de streptococcus pneumoniae Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos antígenos de Streptococcus pneumoniae para la detección de Streptococcus y para la prevención o atenuación de enfermedades provocadas por Streptococcus. La invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican polipéptidos antigénicos de S. pneumoniae. También se proporcionan polipéptidos antigénicos, tales como vectores, células hospedantes y métodos recombinantes para la producción de los mismos. Adicionalmente, la invención se refiere a métodos diagnósticos para la detección de expresión génica de Streptococcus.

Antecedentes de la invención

El Streptococcus pneumoniae ha sido uno de los microorganismos más ampliamente estudiados desde la primera vez que fue aislado en 1881. Fue el objetivo de muchas investigaciones que condujeron a importantes descubrimientos científicos. En 1928, Griffith observó que cuando se eliminaban con calor neumococos encapsulados y concomi- tantemente se inyectaban en ratones cepas vivas que constitutivamente carecían de cualquier cápsula, los no encapsulados pudieron convertirse en neumococos encapsulados con el mismo tipo capsular que la cepa eliminada con calor. Años después, se demostró que la naturaleza de este "principio de transformación", o portador de información genética, era ADN. (Avery, O.T., y col., J. Exp. Med., 79: 137-157 (1944)).

A pesar del vasto número de publicaciones sobre S. pneumoniae, aún quedan sin resolver muchas cuestiones acerca de su virulencia, y dicho patógeno sigue siendo un importante agente causante de enfermedades humanas graves, especialmente la neumonía adquirida por comunidad. (Johnston, R.B., y col., Rev. infecí. Dis. 13 (Supl. 6): S509-517 (1991)). Además, en los países desarrollados, el neumococo es el responsable de la muerte de un gran número de niños de menos de 5 años a través de neumonía por neumococos. La Incidencia de la enfermedad por neumococos es mayor en los niños con menos de 2 años y en la gente con más de 60 años de edad. Los neumococos son la segunda causa más frecuente (después del Haemophilus influenzae tipo b) de meningitis bacteriana y de otitis media en niños. Con la reciente introducción de vacunas conjugadas para el H. influenzae tipo b, la meningitis por neumococos probablemente sea cada vez más predominante. El S. pneumoniae es el agente etiológico más importante de la neumonía adquirida en comunidad en adultos y es la segunda causa más común de meningitis bacteriana detrás de la Neisseria meningitidis.

El antibiótico que se prescribe normalmente para tratar el S. pneumoniae es la bencllpenlclllna, aunque ocasionalmente se produce resistencia a éste y a otros antibióticos. La resistencia del neumococo a la penicilina procede de las mutaciones en sus proteínas de unión a la penicilina. En la neumonía no complicada provocada por una cepa sensible, el tratamiento con penicilina habltualmente tiene éxito salvo que se comience demasiado tarde. También se puede usar eritromicina y clindamicina para tratar la neumonía en pacientes hlpersenslbles a la penicilina, pero existen cepas resistentes a estos fármacos. Los antibióticos de amplio espectro (por ejemplo, las tetraclcllnas) también pueden ser eficaces, aunque las cepas resistentes a tetraclcllna no son raras. A pesar de la disponibilidad de antibióticos, la mortalidad de bacteremia neumococal en las últimas cuatro décadas se ha mantenido estable entre el 25 y el 29%. (Gillespie, S.H., y col., J. Med. Microbio!. 28: 237-248 (1989)).

El S. pneumoniae se encuentra en la parte superior del tracto respiratorio de muchos Individuos saludables. Se ha sugerido que la unión de los neumococos está mediada por un receptor de dlsacárldo sobre fibronectina, presente en las células epiteliales faríngeas humanas. (Anderson, B.J., y col., J. Immunol. 142: 2464-2468 (1989). Los mecanismos mediante los cuales los neumococos se trasladan desde la nasofarlnge hasta los pulmones, provocando con ello la neumonía, o migran a la sangre, dando lugar a bacteremia o a septicemia, son poco conocidos. (Johnston, R.B., y col., Rev. Infecí Dis. 13 (Supl. 6): S509-517 (1991).

Se ha sugerido que varias proteínas están involucradas en la patogenlcldad del S. pneumoniae, sin embargo sólo se ha confirmado que unas pocas de ellas son factores de virulencia. Los neumococos producen una proteasa lgA1 que podría interferir con la defensa del hospedante en las superficies mucosas. (Kornfield, S.J., y col., Rev. Inf. Dis. 3: 521-534 (1981)). El S. pneumoniae también produce neuramlnldasa, una enzima que puede facilitar la unión a células epiteliales mediante la ruptura de ácido siálico procedente de los glicolípidos y gangliósidos del hospedante. Se observó que la neuraminidasa parcialmente purificada induce síntomas similares a la meningitis en ratones; sin embargo la fiabilidad de este descubrimiento ha sido cuestionada debido a que las preparaciones de neuraminidasa usadas probablemente estuvieran contaminadas con productos de la pared celular. Aparte de la neuraminidasa, existen otras proteínas neumococales implicadas en la adhesión de los neumococos a células epiteliales y endoteliales. Estas proteínas neumococales todavía no han sido identificadas. Recientemente, Cundell y col. publicaron que las permea- sas de péptido pueden modular la adherencia neumococal a células epiteliales y endoteliales. Sin embargo, no queda claro si dichas permeasas actúan directamente como adhesiones o si potencian la adherencia modulando la expresión de adhesiones neumococales. (DeVelasco, E.A., y col., Micro. Rev. 59: 591-603 (1995)). Es necesario desarrollar un mejor entendimiento de los factores de virulencia que determinan su patogenicidad para afrontar los efectos devastadores de la enfermedad neumococal en humanos.

Irónicamente, a pesar del importante papel del S. pneumoniae en el descubrimiento del ADN, poco se sabe sobre la genética molecular del organismo. El genoma del S. pneumoniae consiste en un ADN de cadena doble, circular, cerrado covalentemente, y una colección de los denominados elementos accesorios variables, tales como profagos, plásmldos, transposones y otros similares. La mayoría de las características físicas y casi todos los genes del S. pneumoniae siguen siendo desconocidos. Entre los pocos que han sido identificados, la mayoría no han sido mapea- dos físicamente o no han sido caracterizados en detalle. Únicamente se han secuenciado unos pocos genes de este organismo. (Véase, por ejemplo, las versiones actuales del GENBANK y de otras bases de datos de ácidos nucleicos, y las referencias que se refieren al genoma del S. pneumoniae, tales como las presentadas a lo largo de la presente memoria). La identificación de antígenos expresados in vivo, y ampliamente protectores, del S. pneumoniae sigue siendo elusiva.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden pollnucleótldos que codifican los polipéptidos de S. pneumoniae descritos en la Tabla 1, y que presentan las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 66. Por tanto, un aspecto de la Invención proporciona moléculas ácido nucleico aisladas que comprenden pollnucleótldos que presentan una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica las secuencias de aminoácidos del polipéptido mostrado en la Tabla 1; y (b) una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos presentada en (a).

En la presente memoria además se describen las moléculas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que presenta una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en un 90%, y más preferiblemente en al menos un 95%, un 96%, un 97%, un 98% o un 99%, a cualquiera de las secuencias de nucleótidos de los anteriores apartados (a) o (b), o un polinucleótido que se híbrida en condiciones severas de hibridación con un polinucleótido de los anteriores apartados (a) o (b). Dicho polinucleótido que se híbrida, no se híbrida en condiciones severas de hibridación con un polinucleótido que presenta la secuencia de nucleótidos que consiste únicamente en residuos de A o únicamente en residuos de T. Otras realizaciones adicionales de ácido nucleico de la Invención se refieren a moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden polinucleótidos que codifican las secuencias de aminoácido de las porciones portadoras de epftopos de un polipéptido de S. pneumoniae que presenta una secuencia de aminoácido del apartado (a) anterior.

La presente invención también se refiere a vectores recombinantes, que incluyen las moléculas de ácido nucleico aisladas... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en

(a) pollnucleótldos que codifican el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en la SEQ ID NO: 66;

(b) polinucleótidos que tienen la secuencia codificadora mostrada en la SEQ ID NO: 65 que codifica el polipéptido;

(c) polinucleótidos que son idénticos en al menos un 95% a la secuencia codificadora mostrada en la SEQ ID NO: 65,

(d) polinucleótidos que codifican un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 95% a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 66,

(e) polinucleótidos que codifican una porción portadora de epítopo de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

lle-486 a Ala-497; Asp-524 a Ala-535; y His-662 a Gly-674 de la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en la SEQ ID NO: 66; y

(f) polinucleótidos que codifican fragmentos que comprenden al menos 50 aminoácidos contiguos de un polipéptido codificado por un polinucleótido de (a) o (b), donde dichos fragmentos portan un epítopo antigénico;

o la cadena complementaria de dicho polinucleótido.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, que es ADN.

3. El polinucleótido de la reivindicación 1, que es ARN.

4. Un método de producción de un vector recombinante que comprende insertar un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en un vector.

5. Un vector recombinante que contiene el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o producido mediante el método de la reivindicación 4.

6. El vector de la reivindicación 5, en el que el polinucleótido está ligado operativamente a una secuencia de control de expresión que permite la expresión en células hospedantes procarióticas o eucarióticas.

7. Un método de producción de una célula hospedante recombinante que comprende introducir el vector de la reivindicación 5 o 6 en una célula hospedante.

8. Una célula hospedante transformada con el vector de la reivindicación 5 o 6, o producida mediante el método de la reivindicación 7.

9. Un procedimiento para producir un polipéptido codificado por el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende: cultivar la célula hospedante de la reivindicación 8 y recubrir el polipéptido codificado por dicho polinucleótido del cultivo.

10. Un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o que se puede obtener por el procedimiento de la reivindicación 9.

11. Un antígeno de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de una porción portadora de epítopo seleccionada del grupo que consiste en: lle-486 a Ala-497; Asp-524 a Ala-535; His-662 a Gly-674 de la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en SEQ ID NO: 66.

12. Una proteína codificada por un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que carece de la metionina N-terminal.

13. Una proteína de fusión que comprende el polipéptido de la reivindicación 10, y una secuencia de polipéptido heteróloga.

14. Un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de la reivindicación 10.

15. Un hibridoma que produce el anticuerpo de la reivindicación 14.

16. Una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el polipéptido de la reivindicación 10 o un ADN que codifica y que es capaz de expresar dicho polipéptido in vivo o el anticuerpo de la reivindicación 14, y opcionalmente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente acep

table.

17. Una composición de diagnóstico que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o el anticuerpo de la reivindicación 14.

18. Un método de diagnóstico que comprende analizar la presencia del pollpéptido de la reivindicación 10 en 5 una muestra derivada de un hospedante.

19. Un método de detección de ácidos nucleicos de Streptococcus en una muestra biológica obtenida de un animal, que comprende:

(a) poner en contacto la muestra con una o más sondas de ácido nucleico que comprenden el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en unas condiciones en las que se produce hibridación; y

10 (b) detectar la hibridación de dichas una o más sondas con las una o más secuencias de ácido nucleico de

Streptococcus presentes en la muestra biológica.

20. Un método para detectar ácidos nucleicos de Streptococcus en una muestra biológica obtenida de un animal, que comprende:

(a) amplificar una o más secuencias de ácido nucleico de Streptococcus en dicha muestra usando el polinucleó- 15 tido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y reacción en cadena de polimerasa; y

(b) detectar dicho ácido nucleico de Streptococcus amplificado.

21. Un kit para detectar anticuerpos de Streptococcus en una muestra biológica obtenida de un animal, que comprende:

(a) un polipéptido de la reivindicación 10 unido a un soporte sólido; y 20 (b) medios de detección.

22. Un método para detectar anticuerpos de Streptococcus en una muestra biológica obtenida de un animal, que comprende:

(a) poner en contacto la muestra con un polipéptido de la reivindicación 10, y

(b) detectar complejos anticuerpo-antígeno.