Un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en (a) polinucleótidos que codifican el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en la SEQ ID NO:

56; (b) polinucleótidos que tienen la secuencia codificadora mostrada en la SEQ ID NO: 55 que codifica el polipéptido; (c) polinucleótidos que son idénticos en al menos 95% a la secuencia codificadora mostrada en la SEQ ID NO: 55, (d) polinucleótidos que codifican un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos 95% a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 56, (e) polinucleótidos que codifican una porción portadora de epítopo de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: Arg-10 a Arg-17; Lys-29 a Ser-39; Ser-140 a Ala-153; Arg-158 a Tyr-169; Asp-175 a Ala-183; Gly-216 a Asn-236; Ala-261 a Leu-270; Arg-282 a Phe-291; y Thr-297 a Ala-305; Pro-342 a Gln-362; Phe-455 a Asp-463 ; His-497 a Thr-511; Ala-521 a Gly-529; Ile-537 a Val-546; Ile-556 a Ala-568; Pro-581 a Ser-595; Glu-670 a Ala-685; Ser-696 a Ala-705 y Leu-782 a Ser-791 de la secuencia de aminoácidos deducida como se representa en SEQ ID NO:56; y (f) polinucleótidos que codifican fragmentos que comprenden al menos 50 aminoácidos contiguos de un polipéptido codificado por un polinucleótido de uno cualquiera de los apartados (a) a (d) o la cadena complementaria de dicho polinucleótido

Antígenos y vacunas para el Streptococcus pneumonia.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos antígenos de Streptococcus pneumoniae para la detección de Streptococcus y para la prevención o atenuación de enfermedades provocadas por Streptococcus. La invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican polipéptidos antigénicos de S. pneumoniae. También se proporcionan polipéptidos antigénicos, tales como vectores, células hospedantes y métodos recombinantes para la producción de los mismos. Adicionalmente, la invención se refiere a métodos diagnósticos para la detección de expresión génica de Streptococcus.

Antecedentes de la invención

El Streptococcus pneumoniae ha sido uno de los microorganismos más ampliamente estudiados desde la primera vez que fue aislado en 1881. Fue el objetivo de muchas investigaciones que condujeron a importantes descubrimientos científicos. En 1928, Griffith observó que cuando se inyectaban en ratones neumococos encapsulados muertos por calor y concomitantemente cepas vivas que constitutivamente carecían de cualquier cápsula, los no encapsulados pudieron convertirse en neumococos encapsulados con el mismo tipo capsular que la cepa muerta por calor. Años después, se demostró que la naturaleza de este "principio de transformación", o portador de información genética, era ADN. (Avery, O.T., y col., J. Exp. Med., 79: 137-157 (1944)).

A pesar del vasto número de publicaciones sobre S. pneumoniae, aún quedan sin resolver muchas cuestiones acerca de su virulencia, y dicho patógeno sigue siendo un importante agente causante de enfermedades humanas graves, especialmente la neumonía contagiosa. (Johnston, R.B., y col., Rev. Infect. Dis. 13 (Supl. 6): S509-517 (1991)). Además, en los países en vías de desarrollo, el neumococo es el responsable de la muerte de un gran número de niños de menos de 5 años por neumonía neumocócica. La incidencia de la enfermedad neumocócica es mayor en niños con menos de 2 años y en adultos con más de 60 años de edad. Los neumococos son la segunda causa más frecuente (después del Haemophilus influenzae tipo b) de meningitis bacteriana y de otitis media en niños. Con la reciente introducción de vacunas conjugadas para el H. influenzae tipo b, la meningitis por neumococos probablemente sea cada vez más predominante. El S. pneumoniae es el agente etiológico más importante de la neumonía contagiosa en adultos y es la segunda causa más común de meningitis bacteriana detrás de la Neisseria meningitidis.

El antibiótico que se prescribe normalmente para tratar el S. pneumoniae es la bencilpenicilina, aunque ocasionalmente se produce resistencia a éste y a otros antibióticos. La resistencia del neumococo a la penicilina es el resultado de las mutaciones en sus proteínas de unión a la penicilina. En la neumonía neumocócica no complicada provocada por una cepa sensible, el tratamiento con penicilina habitualmente tiene éxito salvo que se comience demasiado tarde. También se puede usar eritromicina y clindamicina para tratar la neumonía en pacientes hipersensibles a la penicilina, pero existen cepas resistentes a estos fármacos. Los antibióticos de amplio espectro (por ejemplo, las tetraciclinas) también pueden ser eficaces, aunque las cepas resistentes a tetraciclina no son raras. A pesar de la disponibilidad de antibióticos, la mortalidad de bacteremia neumocócica en las últimas cuatro décadas se ha mantenido estable entre el 25 y el 29%. (Gillespie, S.H., y col., J. Med. Microbiol. 28: 237-248 (1989)).

El S. pneumoniae se encuentra en la parte superior del tracto respiratorio de muchos individuos saludables. Se ha sugerido que la unión de los neumococos está mediada por un receptor disacárido sobre fibronectina, presente en las células epiteliales faríngeas humanas. (Anderson, B.J., y col., J. Immunol. 142: 2464-2468 (1989). Los mecanismos mediante los cuales los neumococos se trasladan desde la nasofaringe hasta los pulmones, provocando con ello la neumonía, o migran a la sangre, dando lugar a bacteremia o a septicemia, son poco conocidos. (Johnston, R.B., y col., Rev. Infect. Dis. 13 (Supl. 6): S509-517 (1991).

Se ha sugerido que varias proteínas están involucradas en la patogenia del S. pneumoniae, sin embargo sólo se ha confirmado que unas pocas de ellas son factores de virulencia. Los neumococos producen una proteasa IgA1 que podría interferir con la defensa del hospedante en las superficies mucosas. (Kornfield, S.J., y col., Rev. Inf. Dis. 3: 521-534 (1981)). El S. pneumoniae también produce neuraminidasa, una enzima que puede facilitar la unión a células epiteliales mediante la ruptura de ácido siálico procedente de los glicolípidos y gangliósidos del hospedante. Se observó que la neuraminidasa parcialmente purificada inducía síntomas similares a la meningitis en ratones; sin embargo la fiabilidad de este descubrimiento ha sido cuestionada debido a que las preparaciones de neuraminidasa usadas probablemente estuvieran contaminadas con productos de la pared celular. Aparte de la neuraminidasa, existen otras proteínas neumocócicas implicadas en la adhesión de los neumococos a células epiteliales y endoteliales. Estas proteínas neumocócicas todavía no han sido identificadas. Recientemente, Cundell y col. publicaron que las permeasas de péptido pueden modular la adherencia neumocócica a células epiteliales y endoteliales. Sin embargo, no queda claro si dichas permeasas actúan directamente como adhesiones o si potencian la adherencia modulando la expresión de adhesiones neumocócicas. (DeVelasco, E.A., y col., Micro. Rev. 59: 591-603 (1995)). Es necesario desarrollar un mejor entendimiento de los factores de virulencia que determinan su patogenia para acabar con los efectos devastadores de la enfermedad neumocócica en seres humanos.

Irónicamente, a pesar del importante papel del S. pneumoniae en el descubrimiento del ADN, poco se sabe sobre la genética molecular del organismo. El genoma del S. pneumoniae consiste en un ADN de cadena doble, circular, cerrado covalentemente, y una colección de los denominados elementos accesorios variables, tales como profagos, plásmidos, transposones y otros similares. La mayoría de las características físicas y casi todos los genes del S. pneumoniae siguen siendo desconocidos. Entre los pocos que han sido identificados, la mayoría no han sido mapeados físicamente o no han sido caracterizados en detalle. Únicamente se han secuenciado unos pocos genes de este organismo. (Véase, por ejemplo, las versiones actuales del GENBANK y de otras bases de datos de ácidos nucleicos, y las referencias que se refieren al genoma del S. pneumoniae, tales como las presentadas a lo largo de la presente memoria). La identificación de antígenos expresados in vivo, y ampliamente protectores, del S. pneumoniae sigue siendo elusiva.

WO 96/16082 describe variantes de proteínas que se unen a penicilina (PBPs) y, en particular, la proteína PBP 1A de S. pneumoniae que tiene suprimidos los aminoácidos 1-38.

WO 95/06732 describe la identificación de proteínas exportadas por bacterias Gram positivas y sus genes correspondientes. Concretamente, WO95/06732 describe varios genes que codifican proteínas exportadas de S. pneumoniae y vacunas que proporcionan protección contra la infección por bacterias Gram positivas.

Martin, C., et al. (EMBO J., 11(11): 3831-3836 (1992)) describe genes de la proteína 1a que se une a penicilina procedentes de diferentes clones de Streptococcus pneumoniae resistente a penicilina.

WO 95/31548 describe genes del polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae y sus regiones flanqueantes y describe que estas regiones se pueden emplear para detectar S. pneumoniae.

WO 95/14712 describe varias proteínas de Streptococcus pneumoniae que se unen a hemina/hemoglobina y los correspondientes ensayos diagnósticos, vacunas y composiciones farmacéuticas.

WO 96/05895 se refiere a conjugados inmunógenos polisacárido-proteína que tienen un polisacárido oxidado que se obtiene a partir del polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae y la proteína neumolisina de S. pneumoniae que se expresa de forma recombinante. Los conjugados inmunógenos se describen para uso como vacunas...

1. Un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en

o la cadena complementaria de dicho polinucleótido.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, que es ADN.

3. El polinucleótido de la reivindicación 1, que es ARN.

4. Un método de fabricación de un vector recombinante que comprende insertar un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en un vector.

5. Un vector recombinante que contiene el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o producido mediante el método de la reivindicación 4.

6. El vector de la reivindicación 5, en el que el polinucleótido está ligado operativamente a una secuencia de control de expresión que permite la expresión en células hospedantes procarióticas o eucarióticas.

7. Un método para fabricar una célula hospedante recombinante que comprende introducir el vector de la reivindicación 5 ó 6 en una célula hospedante.

8. Una célula hospedante transformada con el vector de la reivindicación 5 ó 6, o producida mediante el método de la reivindicación 7.

9. Un proceso para producir un polipéptido codificado por el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende: cultivar la célula hospedante de la reivindicación 8 y recubrir el polipéptido codificado por dicho polinucleótido del cultivo.

10. Un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o que se puede obtener mediante el proceso de la reivindicación 9.

11. Un antígeno de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de una porción portadora de epítopo de la reivindicación 1 (e) seleccionada del grupo que consiste en: Arg-10 a Arg-17; Lys-29 a Ser-39; Ser-140 a Ala-153; Arg-158 a Tyr-169; Asp-175 a Ala-183; Gly-216 a Asn-236; Ala-261 a Leu-270; Arg-282 a Phe-291; y Thr-297 a Ala-305; Pro-342 a Gln-362; Phe-455 a Asp-463; His-497 a Thr-511; Ala-521 a Gly-529; Ile-537 a Val-546; Ile-556 a Ala-568; Pro-581 a Ser-595; Glu-670 a Ala-685; Ser-696 a Ala-705 y Leu-782 a Ser-791 de la secuencia de aminoácidos deducida como se representa en SEQ ID NO:56.

12. Una proteína codificada por un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que carece de metionina N-terminal.

13. Una proteína de fusión que comprende el polipéptido de la reivindicación 10, y una secuencia de polipéptido heteróloga.

14. Un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de la reivindicación 10.

15. Un hibridoma que produce el anticuerpo de la reivindicación 14.

16. Una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el polipéptido de la reivindicación 10 o un ADN que codifica y que es capaz de expresar dicho polipéptido in vivo o el anticuerpo de la reivindicación 14, y opcionalmente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

17. Una composición de diagnóstico que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o el anticuerpo de la reivindicación 14.

18. El uso del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, del polipéptido de la reivindicación 10, o del anticuerpo de la reivindicación 14, para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención o la atenuación de una infección provocada por un miembro del género Streptococcus.

19. Composición farmacéutica que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el polipéptido de la reivindicación 10, o el anticuerpo de la reivindicación 14 para prevenir o atenuar una infección causada por un miembro del género Streptococcus.

20. Un proceso diagnóstico que comprende analizar la presencia del polipéptido de la reivindicación 10 en una muestra obtenida a partir de un hospedante.

21. La composición farmacéutica de la reivindicación 16, que es una vacuna.

22. La vacuna de la reivindicación 20, que comprende:

23. Un método para detectar ácidos nucleicos de Streptococcus en una muestra biológica obtenida a partir de un animal, que comprende:

24. Un método para detectar ácidos nucleicos de Streptococcus en una muestra biológica obtenida a partir de un animal, que comprende:

25. Un kit para detectar anticuerpos de Streptococcus en una muestra biológica obtenida a partir de un animal, que comprende:

26. Un método para detectar anticuerpos de Streptococcus en una muestra biológica obtenida a partir de un animal, que comprende: