Linfopoyetina estromal tímica humana modificada.

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene almenos un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 4,

modificada para inactivar el sitio deescisión por furina RRKRK en la posición 127-131 de la SEC ID Nº 4, y en la que el polipéptido tiene al menos unaactividad TSLP.

Linfopoyetina estromal tímica humana modificada Remisión a solicitudes relacionadas La presente solicitud reivindica por la presente el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos número de serie 60/307.345, presentada el 23 de julio de 2001.

Antecedentes de la invención Campo de la invención La invención se refiere, en general, a la expresión de proteínas recombinantes. Más específicamente, la invención se refiere a polipéptidos de linfopoyetina estromal tímica (TSLP) humana recombinante modificada que son resistentes a degradación en cultivo celular de mamífero, a secuencias polinucleotídicas que codifican polipéptidos TSLP modificados, y a procedimientos para la producción y uso de TSLP.

Descripción de la técnica relacionada La linfopoyetina estromal tímica (TSLP) es un factor de crecimiento integral del desarrollo y maduración tanto de linfocitos B como de linfocitos T. En particular, TSLP murina soporta la linfopoyesis B y es necesaria para la proliferación de linfocitos B. TSLP murina también es crítica en el control del reordenamiento del locus del receptor gamma para linfocitos T (TCR!) , y tiene un efecto estimulador sustancial sobre timocitos y linfocitos T maduros. Véase, por ejemplo, Friend y col., 1994, Exp. Hematol., 22:321-328; Ray y col., 1996, Eur. J. Immunol., 26:10-16; Candeias y col., 1997, Immunology Letters, 57:9-14.

TSLP tiene actividad citoquina similar a IL-7. Por ejemplo, TSLP puede reemplazar a IL-7 en la estimulación de las respuestas de proliferación de linfocitos B (Friend y col., supra) . Parece que TSLP e IL-7 median sus efectos linfopoyéticos mediante distintos mecanismos. Por ejemplo, IL-7 activa las tirosina quinasas de la familia Janus, incluyendo JAK1 y JAK3, y modula la actividad de la proteína transductora de señales y activadora de la transcripción 5 (STAT5) . Aunque TSLP modula la actividad de STAT5, no logra activar ningún miembro de la familia Janus de tirosina quinasas (Levin y col., 1999, J. Immunol. 162:677-683) . Aunque TSLP e IL-7 median efectos similares sobre células diana, también parecen tener distintas vías de señalización y probablemente alguna variación en su respuesta biológica.

Las actividades conocidas de TSLP en la modulación del sistema inmune, particularmente en la estimulación de la proliferación, desarrollo y maduración de linfocitos B y T, hace de esta molécula una herramienta terapéutica atractiva. La capacidad de producir grandes cantidades del polipéptido activo es esencial para la producción comercial de TSLP humana. La producción de polipéptidos recombinantes en un sistema de expresión de células de mamífero se usa más habitualmente para aplicaciones terapéuticas humanas comerciales.

El polipéptido huTSLP recombinante se ha expresado en varios sistemas de expresión diferentes, incluyendo líneas celulares de mamífero, como se describe en el documento WO 00/29581. Sin embargo, la producción de cantidades útiles de proteína huTSLP activa en células de mamífero ha sido difícil. En particular, la expresión de huTSLP en células de mamífero a menudo produce un producto degradado. Se necesitan moléculas polinucleotídicas alternativas y procedimientos para conseguir la producción de cantidades útiles de polipéptido huTSLP activo.

Sumario de la invención Se comprobó que la secuencia de aminoácidos de TSLP humana contiene una secuencia única de aminoácidos que contiene un sitio de escisión por furina. Las modificaciones de los polipéptidos para inactivar el sitio de escisión por furina, de acuerdo con la presente invención, proporcionan polipéptidos huTSLP resistentes a proteasa modificados que son más estables cuando se expresan en sistemas de células de mamífero en comparación con los polipéptidos TSLP no modificados.

Los polipéptidos TSLP humanos resistentes a proteasa modificados de la invención, incluyen aquellos que tienen una o más modificaciones de secuencia de aminoácidos que alteran e inactivan el sitio de escisión por furina RRKRK, como se muestra en la siguiente Tabla 1, posicionado en aproximadamente los restos de aminoácidos 127131 de la SEC ID Nº 4. Las modificaciones adecuadas incluyen sustituciones, deleciones, adiciones o combinaciones de estas de aminoácidos, que alteran la secuencia de aminoácidos RRKRK para alterar el patrón del sitio de escisión por furina RXXR, en particular aquellos que alteran el patrón RX (R/K) R. También se incluyen polipéptidos que son sustancialmente similares en la secuencia de aminoácidos a los polipéptidos huTSLP modificados, y fragmentos de los mismos, que retienen una actividad deseada de TSLP nativa y son resistentes a proteasa. En una realización, las secuencias RKRK o RKRKV se han delecionado de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos huTSLP.

La invención también proporciona moléculas polinucleotídicas que codifican los polipéptidos huTSLP resistentes a proteasa modificados analizados anteriormente. Las moléculas polinucleotídicas de la invención incluyen aquellas que tienen una modificación de secuencia de ácido nucleico en fase que altera o desactiva de otro modo los codones que codifican el sitio de escisión por furina RRKRK [SEC ID Nº 6] posicionado en los restos de aminoácidos 127-131 de la SEC ID Nº 4. Las modificaciones adecuadas del sitio de escisión incluyen sustituciones, deleciones, adiciones o combinaciones de estas en fase del ácido nucleico, que alteran la secuencia de ácido nucleico que 5 codifica RRKRK para alterar el patrón del sitio de escisión por furina codificado RXXR, particularmente RX (R/K) R. Las realizaciones incluyen, por ejemplo, mutantes de deleción en los que se ha delecionado la secuencia de nucleótidos AGG AGA AAA AGG AAA [SEC ID Nº 5] que codifica RRKRK, o la secuencia de nucleótidos AGA AAA AGG AAA GTC [SEC ID Nº 7] que codifica una secuencia de aminoácidos RKRKV [SEC ID Nº 8]. También se incluyen moléculas polinucleotídicas que tienen secuencias que son sustancialmente similares a las moléculas polinucleotídicas que codifican los polipéptidos TSLP modificados, y fragmentos de los mismos que retienen una actividad deseada de TSLP nativa y son resistentes a proteasa.

La invención también proporciona formas adicionales de polipéptidos huTSLP modificados, incluyendo formas solubles y proteínas de fusión. Por ejemplo, las proteínas de fusión de la invención incluyen polipéptidos huTSLP modificados fusionados a proteínas o péptidos heterólogos que confieren una función deseada, tal como para facilitar la purificación, oligomerización, estabilidad, secreción o identificación del polipéptido. Una proteína de fusión de la invención puede producirse, por ejemplo, a partir de una construcción de expresión que contiene una molécula polinucleotídica que codifica el polipéptido huTSLP resistente a proteasa modificado en fase con una molécula polinucleotídica que codifica la proteína heteróloga.

La invención también proporciona vectores, plásmidos, sistemas de expresión, células huésped, y similares, que contienen una molécula polinucleotídica modificada de huTSLP resistente a proteasa. Los procedimientos de ingeniería genética para la producción de polipéptidos huTSLP modificados de la invención incluyen expresión de las moléculas polinucleotídicas en sistemas sin células, huéspedes celulares, en tejidos, y en modelos animales, de acuerdo con procedimientos conocidos.

La invención incluye adicionalmente composiciones que contienen un polipéptido huTSLP modificado sustancialmente purificado de la invención y un vehículo aceptable. Se prefieren composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración a células, tejidos, o pacientes, que son útiles para inducir las actividades de linfocitos B y linfocitos T en tratamiento terapéutico, por ejemplo, de trastornos inmunodeficitarios, infecciones víricas, e infecciones bacterianas.

Estas y otras diversas características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la lectura de la siguiente 30 descripción detallada y una revisión de las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de las secuencias La SEC ID Nº 1 es una secuencia polinucleotídica que codifica una TSLP murina (GenBank AF232937) .

La SEC ID Nº 2 es la secuencia de aminoácidos de TSLP murina codificada por la SEC ID Nº 1.

La SEC ID Nº 3 es una secuencia polinucleotídica que codifica una TSLP humana (GenBank AY037115) .

La SEC ID Nº 4 es la secuencia de aminoácidos de una TSLP humana codificada por la SEC ID Nº 3.

La SEC ID Nº 5 es una secuencia polinucleotídica AGG AGA AAA AGG AAA, que codifica un sitio de escisión por furina RRKRK.

La SEC ID Nº 6 es la secuencia de aminoácidos RRKRK... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 4, modificada para inactivar el sitio de escisión por furina RRKRK en la posició.

12. 131 de la SEC ID Nº 4, y en la que el polipéptido tiene al menos una actividad TSLP.

2. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en la que el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 10, 12, 14, 16, 17 ó 18, y en la que el polipéptido tiene un sitio de escisión por furina inactivado y al menos una actividad TSLP.

3. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en la que el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 10, 12, 14, 16, 17 ó 18.

4. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en la que el polinucleótido tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEC ID Nº 3 o su complemento, en la que el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene un sitio de escisión por furina inactivado y tiene al menos una actividad TSLP.

5. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende adicionalmente una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína heteróloga en fase con el polinucleótido de la reivindicación 1.

6. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5, en la que la proteína heteróloga es un resto de direccionamiento celular o una marca peptídica.

7. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6, en la que el resto de direccionamiento celular es un anticuerpo que se une a un antígeno de superficie celular o un ligando que se une a un receptor de superficie celular.

8. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5, en la que la proteína heteróloga es un polipéptido Fc.

9. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 una de forma funcional a una secuencia reguladora de la transcripción o la traducción.

10. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 9, en la que dicha secuencia reguladora de la transcripción o la traducción comprende un promotor o potenciador transcripcional.

11. Una proteína que comprende un polipéptido de linfopoyetina estromal tímica (TSLP) humana modificada que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 4 modificada para inactivar el sitio de escisión por furina RRKRK en la posició.

12. 131 de la SEC ID Nº 4, y en la que el polipéptido tiene al menos una actividad TSLP.

12. La proteína de la reivindicación 11, en la que el polipéptido tiene al menos un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 10, 12, 14, 16, 17, ó 18, en la que el polipéptido tiene un sitio de escisión por furina inactivado y al menos una actividad TSLP.

13. La proteína de la reivindicación 11, en la que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 10, 12, 14, 16, 17, ó 18.

14. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en la que el polipéptido está fusionado a una proteína heteróloga.

15. La proteína de la reivindicación 14, en la que la proteína heteróloga es una marca peptídica o un resto de direccionamiento celular.

16. La proteína de la reivindicación 14, en la que la proteína heteróloga es un polipéptido Fc.

17. Un vector que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10.

18. Una célula huésped modificada por ingeniería genética para expresar la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10.

19. Una composición que comprende el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 11-16 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

20. Un procedimiento que comprende incubar una célula huésped modificada por ingeniería genética para expresar la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, y producir un polipéptido resistente a furina que tiene al menos una actividad TSLP humana funcional.

21. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 11-16 para su uso en la estimulación de la proliferación de linfocitos o linfopoyesis.

22. Un procedimiento in vitro para inducir la fosforilación de STAT5 que comprende poner en contacto una muestra que contiene STAT5 con la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 11-16.

23. Un adyuvante de vacuna que comprende la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 11-16 y un vehículo.

24. Uso de la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 o la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 11-16 en la fabricación de un medicamento para estimular la proliferación de linfocitos, para promover la linfopoyesis, o para inducir la fosforilación de STAT5.

25. Un ensayo para detectar la presencia de un agente que reduce la actividad TSLP, comprendiendo dicho ensayo:

a) poner en contacto, en presencia del agente, una célula que expresar receptores de TSLP con una proteína que comprende un polipéptido de linfopoyetina estromal tímica (TSLP) humana modificada, en el que el polipéptido se selecciona entre las secuencias de aminoácidos que consisten en SEC ID Nº 10, 12, 14, 16, 17, y 18; y

b) medir una actividad TSLP en la célula.

26. El ensayo de la reivindicación 25, en el que el polipéptido TSLP humano modificado está fusionado a una proteína heteróloga.

27. El ensayo de las reivindicaciones 25 ó 26, en el que el agente es un anticuerpo que se une a la TSLP humana modificada.

28. El ensayo de una cualquiera de las reivindicacione.

2. 27, en el que la actividad TSLP se mide detectando el crecimiento celular.

29. El ensayo de una cualquiera de las reivindicacione.

2. 27, en el que la actividad TSLP se mide detectando la actividad STAT5 en la célula.

30. Uso de una proteína que comprende un polipéptido TSLP humano modificado para determinar la presencia in vitro de un anticuerpo que se une a TSLP humana modificada que comprende poner en contacto el polipéptido TSLP humano modificado con un anticuerpo, y detectar la unión del anticuerpo a la TSLP humana modificada, en el que el polipéptido TSLP humano modificado está seleccionado entre las secuencias de aminoácidos que consisten en SEC ID Nº 10, 12, 14, 16, 17, y 18.

31. El uso de la reivindicación 30, en el que el polipéptido TSLP humano modificado está fusionado a una proteína heteróloga.

32. El uso de las reivindicaciones 30 ó 31, en el que el anticuerpo es un antagonista de la actividad TSLP.

33. El uso de la reivindicación 32, en el que la unión del anticuerpo a la TSLP humana modificada se detecta midiendo la actividad TSLP.

34. El uso de la reivindicación 33, en el que la actividad TSLP se mide en una célula que expresa receptores de TSLP.

35. El uso de la reivindicación 34, en el que la actividad TSLP se mide detectando el crecimiento celular.

36. El uso de la reivindicación 34, en el que la actividad TSLP se mide detectando la actividad STAT5 en la célula.