Un polipéptido receptor de ligando que induce la apoptosis relacionada con el TNF (TRAIL-R) purificado,

que se une al ligando que induce la apoptosis relacionada con el TNF (TRAIL), en el que el TRAIL-R está caracterizado por comprender la secuencia de aminoácidos VPANEGD.

Receptor que une TRAIL

Antecedentes de la invención

Una proteína conocida como ligando que induce la apoptosis relacionada con el TNF (TRAIL) es un miembro de la familia

de ligandos del factor de necrosis de tumores (Wiley y otros, Immunity, vol. 3, págs. 673-682, (1995) ) . El TRAIL ha demostrado la capacidad para inducir la apoptosis de ciertas células transformadas, incluyendo un cierto número de tipos diferentes de células de cáncer, así como células infectadas víricamente (Solicitud PCT WO 97/01633, y Wiley y otros, véase cita anterior) .

La identificación de la proteína (s) receptor que se une al TRAIL se revelaría útil en el estudio posterior de las actividades

biológicas del TRAIL. Sin embargo, antes de la presente invención, no se había informado de ningún receptor para el TRAIL.

Sumario de la invención

La presente invención está dirigida a una nueva proteína designada como receptor TRAIL (TRAIL-R) , que se une a una proteína conocida como ligando que induce la apoptosis relacionada con el TNF (TRAIL) . Se proporciona el ADN que 15 contiene la codificación de TRAIL-R, como se define en las reivindicaciones, y los vectores de expresión que comprenden dicho ADN. Un procedimiento para la producción de polipéptidos TRAIL-R comprende el cultivo de células hospedadoras transformadas con un vector de expresión recombinante que contiene la codificación de TRAIL-R, bajo condiciones que promueven la expresión de TRAIL-R y, a continuación, la recuperación de los polipéptidos TRAIL-R expresados a partir del cultivo. Igualmente se proporcionan anticuerpos que se dirigen contra y que son inmunorreactivos con un polipéptido

TRAIL-R que se une a un ligando que induce la apoptosis relacionada con el TNF (TRAIL) , en el que TRAIL-R está caracterizado por comprender la secuencia de aminoácidos VPANEGD o un fragmento de unión al antígeno de dicho anticuerpo, en el que el anticuerpo se puede obtener usando una proteína TRAIL-R en forma de inmunógeno, dicha proteína TRAIL-R se puede obtener de células Jurkat, por medio de la disrupción de las células y purificación subsiguiente incluyendo cromatografía por afinidad, empleando una matriz de cromatografía que contiene TRAIL.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 presenta la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN del receptor humano TRAIL, así como la secuencia de aminoácidos codificada por él. Este fragmento de ADN se describe en el Ejemplo 3.

La Figura 2 presenta los resultados del ensayo descrito en el Ejemplo 7. En el ensayo, una proteína de fusión TRAIL-R/Fc soluble bloqueó la apoptosis inducida por TRAIL de células Jurkat.

La Figura 3 presenta los resultados del experimento descrito en el Ejemplo 8. Los compuestos indicados demostraron que inhibían la apoptosis de células que expresan el receptor TRAIL.

Descripción detallada de la invención

Se proporciona aquí una nueva proteína designada como receptor TRAIL (TRAIL-R) . El TRAIL-R se une a la citocina designada como ligando que induce la apoptosis relacionada con el TNF (TRAIL) . Ciertos usos del TRAIL-R proceden de

esta capacidad para unirse al TRAIL, tal como se expone aquí más adelante. El TRAIL-R encuentra su uso en la inhibición de actividades biológicas del TRAIL, o en la purificación del TRAIL, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad.

La secuencia de nucleótidos de la región de codificación de un ADN del receptor humano TRAIL se presenta en la SEC ID Nº:1. La secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ADN de la SEC ID Nº:1, se muestra en la SEC ID Nº:2. Esta información de la secuencia identifica la proteína Receptor TRAIL como un miembro de la familia de receptores, el

receptor del factor de necrosis de tumores (revisada por Smith y otros, en Cell, vol. 76, págs. 959-962, (1994) ) . El dominio extracelular contiene repeticiones ricas en cisteína; dichos motivos se ha informado que son importantes para la unión de ligandos en otros receptores de esta familia. El TRAIL-R contiene un denominado "dominio muerte" en la región citoplásmica; dichos dominios en otros ciertos receptores están asociados con la transducción de señales apópticas. Estas y otras características de la proteína se exponen con mayor detalle más adelante.

45 En una realización de la invención, los anticuerpos anteriores son anticuerpos monoclonales.

Una proteína TRAIL-R humana se purificó tal como se describe en el Ejemplo 1. En el Ejemplo 2, se presenta la información de la secuencia de aminoácidos derivados a partir de fragmentos de TRAIL-R. Una realización de la invención está dirigida a una proteína TRAIL-R humana purificada que es capaz de unirse al TRAIL, en la que el TRAIL-R se caracteriza por comprender la secuencia de aminoácidos VPANEGD (aminoácidos 327 a 333 de la SEC ID Nº:2) . En otra 50 realización, el TRAIL-R comprende adicionalmente la secuencia ETLRQCFDDFADLVPFDSWEPLMRKLGLMDNEIKVAKAEAAGHRDTLXTML (aminoácidos 336 a 386 de la SEC ID Nº:2,

con un aminoácido desconocido indicado como X) . Igualmente, se proporcionan fragmentos de TRAIL-R que comprenden únicamente una de estas secuencias de aminoácidos caracterizantes.

La secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN de TRAIL-R, y la secuencia de aminoácidos codificada por ella, se presentan en la Figura 1 (SEC ID Nº:3 y SEC ID Nº:4) ; véase Ejemplo 3. La secuencia de aminoácidos presentada en la Figura 1 tiene características de los denominados "dominios muerte" encontrados en la región citoplásmica de otras ciertas proteínas receptores. De dichos dominios se ha informado que están asociados con la transducción de señales apópticas. Los dominios muerte citoplásmicos han sido identificados en el antígeno Fas (Itoh y Nagata, J. Biol. Chem., vol. 268, pág. 10932, (1993) ) , en el receptor tipo I del TNF (Tartaglia y otros, Cell, vol. 74, pág. 845, (1993) ) , en DR3 (Chinnaiyan y otros, Science, vol. 274, págs. 990-992, (1996) ) , y en CAR-1 (Brojatsch y otros, Cell, vol. 87, págs. 845-855, (1996) ) . La función de estos dominios muerte en la iniciación de cascadas de señalamiento apóptico intracelular se expone adicionalmente más adelante.

La SEC ID Nº:1 presenta la secuencia de nucleótido de la región de codificación de un ADN de Receptor humano TRAIL, incluyendo un codón de iniciación (ATG) y un codón de terminación (TAA) . La secuencia de aminoácido codificada por el ADN de la SEC ID Nº:1 se presenta en la SEC ID Nº:2. El fragmento representado en la Figura 1 corresponde a la región del TRAIL-R que se presenta como los aminoácidos 336 a 386 en la SEC ID Nº:2.

La proteína TRAIL-R de la SEC ID Nº:2 incluye una región hidrófoba N-terminal que funciona como un péptido señal, seguida de un dominio extracelular, una región transmembrana que comprende los aminoácidos 211 a 231, y un dominio citoplásmico C-terminal. El análisis mediante ordenador predice que el péptido señal corresponde a los restos 1 a 51 de la SEC ID Nº:2. De acuerdo con ello, la escisión del péptido señal proporcionaría una proteína madura que comprende los aminoácidos 52 a 440 de la SEC ID Nº:2. El peso molecular calculado para una proteína madura que contiene los restos 52 a 440 de la SEC ID Nº:2 es aproximadamente de 43 kilodaltons. Los sitios de escisión de peptidasa señal predecidos mediante ordenador los más probablemente a continuación (en orden descendente) , se producen después de los aminoácidos 50 y 58 de la SEC ID Nº:2.

En otra realización de la invención, el resto N-terminal de una proteína TRAIL-R madura es el resto isoleucina en la posición 56 de la SEC ID Nº:2. Las secuencias de varios fragmentos péptidos de digestión tríptica de TRAIL-R se determinaron mediante una combinación de secuenciación N-terminal y Nano-ES MS/MS (nano electropulverización en tándem con espectroscopía de masa) . El aminoácido N-terminal de uno de los fragmentos péptidos fue la isoleucina en la posición 56 de la SEC ID Nº:2. Puesto que este fragmento no estuvo precedido por un sitio de escisión tripsina, el resto 56 (ILe) puede corresponder al resto N-terminal resultante de la escisión del péptido señal.

Una realización adicional de la invención está dirigida a TRAIL-R maduro que tiene el aminoácido 54 como el resto Nterminal. En una preparación...

1. Un polipéptido receptor de ligando que induce la apoptosis relacionada con el TNF (TRAIL-R) purificado, que se une al ligando que induce la apoptosis relacionada con el TNF (TRAIL) , en el que el TRAIL-R está caracterizado por comprender la secuencia de aminoácidos VPANEGD.

2. Un polipéptido TRAIL-R de la Reivindicación 1, en el que dicho polipéptido está caracterizado además por un peso molecular de aproximadamente 50 a 55 kilodaltons, tal como se determina mediante SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida.

3. Un polipéptido TRAIL-R de la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2, en el dicho polipéptido está caracterizado además por comprender la secuencia de aminoácidos ETLRQCFDDFADLVPFDSWEPLMRKLGLMDNEIKVAKAEAAGHRDTLXTML.

4. Un polipéptido TRAIL-R purificado seleccionado entre el grupo que consiste en:

(a) el polipéptido TRAIL-R de la SEC ID Nº:2; y

(b) un polipéptido que comprende los aminoácidos x a 440 de la SEC ID Nº:2, en el que x representa un número entero del 51 al 59; y

(c) un polipéptido que comprende los aminoácidos 54 a 440 de la SEC ID Nº:2.

5. Un polipéptido TRAIL-R, en el que dicho polipéptido es un TRAIL-R soluble que consiste en los aminoácidos x a 210 de la SEC ID Nº:2, en el que x representa un número entero del 51 al 59.

6. Un polipéptido TRAIL-R de la Reivindicación 5, que comprende los aminoácidos 52 a 210 de la SEC ID Nº:2.

7. Un oligómero que comprende desde dos hasta cuatro polipéptidos TRAIL-R de la Reivindicación 4, o desde dos hasta cuatro polipéptidos TRAIL-R de la Reivindicación 5 o la Reivindicación 6.

8. Una composición que comprende un polipéptido TRAIL-R de la Reivindicación, 4, 5 ó 6, y un diluyente, excipiente o vehículo aceptable fisiológicamente,

9. Un ADN de TRAIL-R aislado que contiene el código de un polipéptido TRAIL-R, en el que dicho polipéptido TRAIL-R se une al ligando que induce la apoptosis relacionada con el TNF (TRAIL) , en el que dicho ADN comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº:3.

10. Un ADN de TRAIL-R aislado, en el que dicho ADN contiene el código de un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en:

(a) el polipéptido TRAIL-R de la SEC ID Nº:2; y

(b) un polipéptido que consiste en los aminoácidos x a 440 de la SEC ID Nº:2, en el que x representa un número entero del 51 al 59; y

(c) un polipéptido que consiste en los aminoácidos 54 a 440 de la SEC ID Nº:2.

11. Un ADN de TRAIL-R aislado, en el que dicho ADN contiene el código de un polipéptido es un TRAIL-R soluble que comprende los aminoácidos x a 210 de la SEC ID Nº:2, en el que x representa un número entero del 51 al 59.

12. Un ADN de TRAIL-R de la Reivindicación 11, en el que dicho ADN codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 52 a 210 de la SEC ID Nº:2.

13. Un vector de expresión que comprende un ADN que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a) el polipéptido TRAIL-R de la SEC ID Nº:2; y

(b) un polipéptido que consiste en los aminoácidos x a 440 de la SEC ID Nº:2, en el que x representa un número entero del 51 al 59; y

(c) un polipéptido que consiste en los aminoácidos 54 a 440 de la SEC ID Nº:2.

14. Una célula hospedadora transformada con una expresión de la Reivindicación 13.

15. Un anticuerpo que está dirigido contra y que es inmunorreactivo con un polipéptido TRAIL-R de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un fragmento de unión al antígeno de dicho anticuerpo, en el que el anticuerpo se puede obtener usando una proteína TRAIL-R como un inmunógeno, dicha proteína TRAIL-R se puede obtener de células Jurkat, por

medio de la disrupción de las células y purificación subsiguiente incluyendo cromatografía por afinidad, empleando una matriz de cromatografía que contiene TRAIL y HPLC de fase inversa.

16. Un anticuerpo de la Reivindicación 15, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

17. Una composición que comprende un anticuerpo de la Reivindicación 15 o la Reivindicación 16 y un diluyente, excipiente o vehículo aceptable fisiológicamente.

FIGURA 1 FIGURA 2

FIGURA 3