Métodos para purficación de proteína.

Un método para purificar una proteína de una muestra que incluye a la proteína y al menos una proteína contaminante que comprende someter la muestra a cromatografía sobre hidroxiapatita,

por medio de la cual se separa la proteína de al menos una proteína contaminante, en donde la mayoría de las moléculas de la proteína se recuperan en el flujo y lavado, en donde la proteína ha sido previamente purificada por medio de cromatografía de afinidad utilizando una segunda proteína fijada a un soporte sólido como adsorbente, en donde las segunda proteína se enlaza específicamente a un dominio constante del anticuerpo inmunoglobulina, y en donde la proteína incluye un dominio constante del anticuerpo inmunoglobulina.

Métodos para purificación de proteína

Esta solicitud reivindica el beneficio de tres solicitudes provisionales, la solicitud estadounidense No. 60/343.363, presentada el 21 de diciembre de 2001, la solicitud estadounidense No. 60/347.189, presentada el 8 de enero de 2002 y la solicitud estadounidense No. 60/364.272, presentada el 12 de marzo de 2002.

Campo de la invención

la invención se relaciona con la purificación de proteína, en particular, con la purificación utilizando cromatografía sobre hidroxiapatita.

Antecedentes

Se emplean a menudo las Proteínas A y G para purificar anticuerpos por medio de cromatografía de afinidad. Ver, por ejemplo R. Vola y colaboradores (1994) , Cell Biophys. 24 - 25: 27 - 36; Aybay e Imir (2000) , J. Immunol. Methods 233 (1 - 2) : 77 - 81; Ford y colaboradores (2001) , J. Chromatogr. B 754: 427 - 435; DE 42 05 938. Estas proteínas son útiles debido a que se enlazan a una porción constante (FC) de muchos anticuerpos diferentes. Las proteínas recombinantes de fusión que incluyen una porción FC de un anticuerpo IgG se pueden purificar utilizando métodos similares.

Cuando se produce una proteína para uso farmacológico, es importante retirar contaminantes tóxicos o inmunogénicos, tal como otras proteínas. Específicamente, la Proteína A es inmunogénica y, en grandes cantidades, potencialmente tóxica. Alguna Proteína A puede filtrarse dentro de una muestra durante cromatografía de afinidad cuando se utiliza como absorbente la Proteína A fijada a un soporte sólido. Ver, por ejemplo, Bensinger y colaboradores (1984) , J. Biol. Response Modif. 3: 347 - 351; Ventura y colaboradores (1987) , Cancer Treat. Rep. 71 (4) : 411 - 413.

Se han separado los anticuerpos monoclonales biespecíficos de otros anticuerpos enlazándolos y eluyéndolos de hidroxiapatita posteriormente a una purificación previa por medio de cromatografía de afinidad utilizando Proteína A fijada a un soporte sólido como adsorbente. Tarditi y colaboradores (1992) , J. Chromatography 599: 13-20; Ford y colaboradores (2001) , J. Chromatography B 754: 427 -435. También se han enlazado y eluido anticuerpos monoclonales de hidroxiapatita. Ahmad (1999) , Ceramic Hydroxyapatite as a Polishing Step for Monoclonal Antibody Purification, Resumen de la Recover y of Biological Products Meeting #9 en Whistler, British Columbia.

La presente invención proporciona un proceso simplificado y de amplia aplicación para utilizar cromatografía sobre hidroxiapatita para la purificación de anticuerpos y de otras proteínas.

Resumen de la invención

La cromatografía de afinidad es una poderosa herramienta para purificación de proteínas tal como anticuerpos y proteínas de fusión FC. Sin embargo, si se fabrican las proteínas para uso terapéutico, la presencia de otras proteínas, incluida una proteína usada como parte de un absorbente de afinidad, que puede filtrarse dentro de una muestra durante la cromatografía de afinidad, es motivo de preocupación. Además, pueden estar presentes otros contaminantes de proteína en una muestra, tales como, por ejemplo, proteínas derivadas de células huésped que producen la proteína que está siendo purificada. La invención proporciona, entre otras cosas, una técnica de alto rendimiento para resolver el problema de purificar una proteína TNFR:FC a través de cromatografía sobre hidroxiapatita en un modo de flujo, tal como se define en las reivindicaciones el cual involucra un procesamiento mínimo.

La invención proporciona además un método para purificar una proteína TNFR:FC de una muestra que incluye la proteína TNFR:FC y al menos una proteína contaminante que comprende someter a la muestra a cromatografía sobre hidroxiapatita, en donde la proteína es separada de al menos una proteína contaminante por medio de cromatografía sobre hidroxiapatita en una solución en la cual se lleva a cabo la cromatografía sobre hidroxiapatita, en donde la mayor parte de las moléculas de la proteína TNFR:FC son recuperadas en el flujo y el lavado, en donde la proteína TNFR:FC ha sido previamente purificada por cromatografía de afinidad utilizando una segunda proteína fijada a un soporte sólido como un absorbente, como se define en las reivindicaciones. La segunda proteína puede o no estar presente en un nivel detectable en la muestra, y la proteína se puede separar de la segunda proteína por medio de cromatografía sobre hidroxiapatita en la solución utilizada. La proteína y al menos una proteína contaminante pueden haber sido secretadas en un medio de cultivo por células animales cultivadas, tales como las células CHO. La proteína es TNFR: FC. La segunda proteína puede ser Proteína A y Proteína G. La solución en la cual se realiza la cromatografía sobre hidroxiapatita puede incluir un amortiguador de fosfato de sodio en una concentración aproximadamente entre 5 milimolar y aproximadamente 50 milimolar, opcionalmente aproximadamente entre 15 milimolar y aproximadamente 35 milimolar, y puede tener un pH entre aproximadamente 6, 0 y aproximadamente 8, 6.

También se describe aquí un método para separar una proteína recombinante de fusión de una segunda proteína que comprende someter a la proteína recombinante de fusión a cromatografía sobre hidroxiapatita cuando (1) la proteína recombinante de fusión ha sido previamente purificada por medio de cromatografía de afinidad utilizando la segunda proteína fijada a un soporte sólido como un absorbente y (2) la proteína recombinante de fusión incluye una porción FC de un anticuerpo y parte o todo de una proteína que no es un anticuerpo. En una modalidad, la proteína recombinante de fusión puede ser TNFR: FC.

También se describe un método para separar una proteína recombinante de fusión de una segunda proteína que comprende someter a la proteína recombinante de fusión a cromatografía sobre hidroxiapatita cuando (1) la proteína recombinante de fusión no se enlaza a la hidroxiapatita y la segunda proteína se enlaza a hidroxiapatita bajo las condiciones utilizadas, (2) la proteína recombinante de fusión ha sido previamente purificada por medio de cromatografía de afinidad utilizando a la segunda proteína fijada a un soporte sólido como un absorbente, y (3) la proteína recombinante de fusión incluye a la región FC de un anticuerpo.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para purificar una proteína recombinante de fusión de una muestra como se define en las reivindicaciones. La mayoría de las moléculas de la proteína recombinante de fusión se pueden recuperar en el flujo y el lavado. La proteína recombinante de fusión es TNFR:FC y la segunda proteína puede ser Proteína A o Proteína G. La cromatografía sobre hidroxiapatita se puede llevar a cabo en una solución que incluye un amortiguador de fosfato de sodio, opcionalmente en una concentración entre 5 milimolar y aproximadamente 50 milimolar o aproximadamente entre 15 milimolar y aproximadamente 35 milimolar y opcionalmente a un pH entre aproximadamente 6, 0 y aproximadamente 8, 6. La proteína recombinante de fusión y/o al menos una proteína contaminante pueden ser secretadas dentro de un medio de cultivo por células animales cultivadas, opcionalmente células CHO. También se describe un método para separar TNFR:FC de Proteína A que comprende someter la TNFR:FC a cromatografía sobre hidroxiapatita después de la purificación de TNFR:FC por medio de cromatografía de afinidad utilizando Proteína A fijada a un soporte sólido como adsorbente.

Se describe adicionalmente aquí un método para purificar TNFR:FC que comprende someter una muestra que contiene TNFR:FC y al menos una proteína contaminante a cromatografía sobre hidroxiapatita bajo condiciones en donde la mayor parte de las moléculas de TNFR:FC son recuperadas en el flujo y lavado.

También se describe un método para purificar TNFR:FC que comprende someter TNFR:FC a cromatografía sobre hidroxiapatita bajo condiciones donde TNFR:FC no se enlaza a la hidroxiapatita, por lo cual TNFR:FC se separa de al menos una proteína contaminante.

También se describe aquí un método para separar una proteína recombinante de fusión de proteínas de la célula huésped, que comprende cargar una muestra que contiene la proteína recombinante de fusión sobre hidroxiapatita, sometiendo a la proteína recombinante de fusión a cromatografía sobre hidroxiapatita bajo condiciones donde la proteína recombinante de fusión no se enlaza a la hidroxiapatita, y recuperando una... [Seguir leyendo]

1. Un método para purificar una proteína TNFR:FC de una muestra que incluye la proteína TNFR:FC y al menos una proteína contaminante que comprende someter la muestra a cromatografía sobre hidroxiapatita, por medio de la cual se separa la proteína TNFR:FC de al menos una proteína contaminante, en donde la mayoría de las moléculas de la proteína TNFR:FC se recuperan en el flujo y lavado, en donde la proteína TNFR:FC ha sido previamente purificada por medio de cromatografía de afinidad utilizando una segunda proteína fijada a un soporte sólido como adsorbente, en donde las segunda proteína se enlaza específicamente a un dominio constante del anticuerpo inmunoglobulina, y en donde la proteína incluye un dominio constante del anticuerpo inmunoglobulina.

2. Un método para purificar una proteína TNFR:FC que comprende:

(a) someter la proteína TNFR:FC y al menos una proteína contaminante a cromatografía de afinidad utilizando una segunda proteína fijada a un soporte sólido como adsorbente, en donde la segunda proteína se enlaza específicamente al dominio constante del anticuerpo inmunoglobulina TNFR:FC; y

(b) someter luego la proteína TNFR:FC y al menos una proteína contaminante a cromatografía sobre hidroxiapatita en donde la mayoría de las moléculas de la proteína TNFR:FC se recupera en el flujo y lavado, por medio de lo cual se separa la proteína TNFR:FC de al menos una proteína contaminante.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en donde la segunda proteína está presente en un nivel detectable en la muestra y en donde la proteína TNFR:FC se separa de la segunda proteína por medio de la cromatografía sobre hidroxiapatita.

4. El método de la reivindicación 1, 2 ó 3, en donde la proteína TNFR:FC ha sido secretada dentro de un medio de cultivo por células animales cultivadas.

5. El método de la reivindicación 4, en donde las células animales son células CHO.

6. El método de la reivindicación 1 ó 2, en donde la segunda proteína es seleccionada del grupo que consiste de Proteína A y Proteína G.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la cromatografía sobre hidroxiapatita se lleva a cabo en una solución que contiene fosfato de sodio en una concentración aproximadamente entre 5 milimolar y aproximadamente 50 milimolar y que tiene un pH aproximadamente entre 6, 0 y aproximadamente 8, 6.

8. Un método para purificar una proteína TNFR:FC recombinante de fusión a partir de una muestra que contiene a la proteína TNFR:FC recombinante de fusión y al menos una proteína contaminante que comprende someter a la muestra a cromatografía sobre hidroxiapatita, en donde la proteína TNFR:FC recombinante de fusión ha sido previamente purificada por medio de cromatografía de afinidad utilizando una segunda proteína fijada a un soporte sólido como adsorbente, y en donde la mayoría de las moléculas de la proteína TNFR:FC recombinante de fusión se recuperan en el flujo y lavado.

9. Un método para purificar una proteína TNFR:FC recombinante de fusión que comprende someter a la proteína TNFR:FC recombinante de fusión y al menos una proteína contaminante a cromatografía de afinidad utilizando una segunda proteína fijada a un soporte sólido como adsorbente antes de someter a la proteína TNFR:FC recombinante de fusión y al menos una proteína contaminante a cromatografía sobre hidroxiapatita, en donde la mayoría de las moléculas de la proteína TNFR:FC recombinante de fusión se recuperan en el flujo y lavado.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, en donde la segunda proteína es seleccionada del grupo que consiste de Proteína A y de Proteína G.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde la cromatografía sobre hidroxiapatita se lleva a cabo en una solución que contiene fosfato de sodio en una concentración aproximadamente entre 5 milimolar y aproximadamente 50 milimolar y que tiene un pH aproximadamente entre 6, 0 y aproximadamente 8, 6.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en donde la proteína TNFR:FC recombinante de fusión ha sido secretada dentro de un medio de cultivo por medio de células animales cultivadas.

13. El método de la reivindicación 12, en donde las células animales son células CHO.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patente citados en la descripción

Literatura citada en la descripción que no es de patente:

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