Derivados de la cadena gamma del receptor de IL-2, su preparación y su uso.

Un fragmento de polipéptido que se une a cinasa que induce NF-κ

B (NIK) de la cadena gamma común (cγc) del receptor de IL-2 seleccionado entre el grupo consistente en:

(i) SEQ ID NO: 1 o un fragmento de polipéptido que se une a NIK de la misma;

(ii) una muteína que se une a NIK de un fragmento de polipéptido que se une a NIK de la cγc del receptor de IL-2 de (i) en la que hasta 25% de los residuos de aminoácidos se han delecionado, añadido o sustituido;

(iii) una molécula lineal que se une a NIK permutada circularmente de un fragmento de polipéptido que se une a NIK de la cγc del receptor de IL-2 de (i); y

(iv) el fragmento de polipéptido de cγc de SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21.

Derivados de la cadena gamma del receptor de IL-2, su preparación y su uso.

Campo de la invención

Esta invención se refiere al uso de la cadena gamma común (cγc) de IL-2 y moléculas relacionadas para la modulación de actividades de señal controladas por NIK, y algunas de tales moléculas nuevas.

Antecedentes de la invención El factor nuclear κB (NF-κB) es una familia de complejos del factor de transcripción eucariótico inducible que participan en la regulación de la respuesta inmune, el crecimiento celular y la supervivencia [Ghosh et al. 1998]. Los factores NF-κB son secuestrados normalmente en el compartimento citoplásmico por asociación física con una familia de inhibidores ricos en anquirina citoplásmica, denominados IκB, incluyendo IκBα y proteínas relacionadas [Baldwin et al. 1996]. En respuesta a diversos estímulos, incluyendo citocinas, mitógenos y ciertos productos génicos víricos, el IκB es rápidamente fosforilado en las serinas 32 y 36, ubicuitinado y después degradado por el proteosoma 26S, que permite translocar al núcleo el NF-κB liberado y participar en la transactivación del gen diana [Mercurio et al. 1999, Pahl et al. 1999]. Recientes estudios de clonación molecular han identificado una cinasa de IκB de múltiples subunidades que media la fosforilación inducida por señal de IκB. La IKK se compone de dos subunidades catalíticas, IKKα e IKKβ, y una subunidad reguladora IKKγ. La actividad catalítica tanto de IKKα como de IKKβ puede ser activada por una multitud de inductores de NF-κB diferentes, incluyendo las citocinas inflamatorias, el factor de necrosis tumoral y la interleucina-1, el receptor de linfocitos T y la proteína coestimuladora de linfocitos T, CD28 [Karin et al. 2000].

La cinasa inductora de NF-κB, NIK, (MAP3K14) es una proteína cinasa activada por mitógeno (MAP3K) que fue descubierta por los autores de la presente solicitud en 1996 (documento WO9737016) mientras escrutaban en busca de proteínas que se unían a la proteína adaptadora asociada al receptor de TNF, TRAF2 [Rothe et al. 1994, Takeuchi et al. 1996]. La activación marcada de NF-κB tras la expresión en exceso de esta proteína cinasa, y la inhibición eficaz de la activación de NF-κB en respuesta a una variedad de agentes inductores (LMP1, TNFR1, TNFR2, RANK, hTol1R, CD3/CD28, interleucina-1R, Tax del virus linfotrópico de linfocitos T humanos-1, LPS y otros [Malinin et al. 1997, Sylla et al. 1998, Damay et al. 1999, Lin et al. 1999, Geleziunas et al. 1998] tras la expresión de mutantes de NIK catalíticamente inactivos, sugirieron que NIK participa en la señalización para la activación de NF

κB [Malinin et al. 1997].

La desorganización dirigida del gen NIK [Yin et al. 2001] y el estudio de una cepa de ratón de origen natural con una mutación puntual de sentido erróneo en NIK (glicina a arginina en el codón 855 de mNIK) [Shinkaura et al. 1999] revelaron un papel esencial de NIK en el desarrollo de órganos linfoides, por ello la cepa mutante de ratones se ha denominado ratones “con alinfoplasia (aly) ”. Los ratones tanto aly/aly como con el gen NIK desactivado manifiestan una ausencia generalizada de ganglios linfáticos y de placas de Peyer, estructuras esplénicas y tímicas desorganizadas e inmunodeficiencia cuyos rasgos más resilientes son niveles bajos de Ig en suero y carencia de rechazo a injertos [Shinkaura et al. 1999]. Estas anomalías reflejan aparentemente una señalización aberrante de una variedad de receptores. Las deficiencias evolutivas de los ratones mutantes para NIK se asemejan a aquellas encontradas en ratones carentes del receptor de LTβ (LTβR) , sugiriendo que NIK participa en la señalización a través de este receptor concreto. Se pudo demostrar que el deterioro de la capacidad proliferativa de los linfocitos B en los ratones aly/aly se corresponde con una respuesta deficiente de estas células frente a LPS y CD40L [Garceau et al. 2000] y la presencia de cantidades excesivas de linfocitos B1 en la cavidad peritoneal de los ratones pudo ser adscrita a defectos en el alojamiento de células peritoneales en el sistema tisular linfático asociado al intestino, como consecuencia de una señalización deficiente del receptor de quimiocina en el tejido linfoide secundario [Fagarasan et al. 2000].

Aparte de estas y probablemente otras contribuciones a la regulación del desarrollo y la función del sistema inmune, también parece que NIK está implicada en la regulación de diferentes funciones no inmunes. Los ratones aly/aly (aunque no los que tienen el gen NIK desactivado) muestran un desarrollo deficiente de la glándula mamaria [Miyawaki 1994]. Por otra parte, estudios in vitro implicaron a NIK en la señalización que conduce a la diferenciación de las células de la musculatura esquelética [Canicio et al. 2001] y en la supervivencia y diferenciación de las neuronas [Foher et al. 2000].

Coincidiendo con el papel sugerido de NIK como mediadora de la activación de NF-κB, los fibroblastos obtenidos a partir de ratones aly/aly y NIK-/- no lograban activar NF-κB en respuesta a la activación de LTβR. Por otra parte, la regulación al alza con LTβR de VCAM-1, que se produce por medio de la activación de NF-κB, es anómala en fibroblastos embrionarios murinos aly/aly [Matsumoto et al. 1999]. También se ha observado una fosforilación deficiente de IκB en respuesta a linfocitos B aly/aly para la ligación a CD40. En contraste, en células dendríticas de estos ratones la fosforilación de IκB inducida por CD40 parecía normal [Garceau et al. 1998]. Las células peritoneales aly/aly también son incapaces de responder a la quimiocina SLC con un incremento de la actividad de NF-κB [Fagarasan et al. 2000]. Sin embargo, en ninguna de las células examinadas hasta ahora se encontró que el efecto de TNF o IL-1 sobre la activación de NF-κB fuera anulado por la mutación de NIK.

La evaluación del patrón de las especies de NF-κB en órganos linfoides de ratones aly/aly indicó que, aparte de su papel en la regulación de los complejos de NF-κB compuesto por las proteínas Rel (A+p50) e IκB, NIK también participa en el control de la expresión/activación de otras especies de NF-κB. Muy notablemente, los linfocitos de los ratones aly/aly eran deficientes en p52, una especie de NF-κB que se forma específicamente en linfocitos B maduros a través del procesamiento proteolítico de un precursor inactivo, p100 (NF-κB2) , sugiriendo una deficiencia en la conversión de p100-p52 [Yamada et al. 2000]. En efecto, se ha demostrado que NIK participa en la fosforilación específica del sitio de p100. Ambos directamente y a través de la fosforilación de IKKα, que a su vez fosforila p100. Esta fosforilación sirve como desencadenante molecular para la ubicuitinación y el procesamiento activo de p100 para formar p52. Se encontró que esta actividad de procesamiento de p100 era anulada por la mutación aly [Xiao et al. 2001, Senftleben et al. 2001].

A la vista de la homología estructural de NIK con las MAP3Ks, se han realizado algunos intentos para explorar la implicación de NIK en las otras tres principales cascadas de proteína cinasa que se sabe que implican a las MAP3Ks (las cascadas de MAP cinasa: cascadas ERK, JNK y p38) [Akiba et al. 1998]. Aunque en ciertas células, NIK parece no participar en ninguna de estas cascadas, algunas otras células (PC12) parecen implicar a NIK en la cascada ERK [Fochr et al. 2000]. Asimismo se ha demostrado que en ciertas células, NIK puede participar en la señalización para la fosforilación de Jun, la diana aguas abajo de la cascada JNK, de un modo que es independiente de esta cascada concreta [Akiba et al. 1998, Natoli et al. 1997]. En conjunto, estos descubrimientos indican que NIK sirve en efecto como mediador de la activación de NF-κB, pero también puede servir para otras funciones, y que ejerce estas funciones de una manera específica de la célula y del receptor.

Como otras MAP3Ks, NIK puede ser activada como consecuencia de la fosforilación del “bucle de activación” dentro de la molécula de NIK. En efecto, la mutación de un sitio de fosforilación dentro de este bucle (Thr-559) evita la activación de NF-κB tras la expresión en exceso de NIK [Lin et al. 1999]. Además, la actividad de NIK parece estar regulada a través de la capacidad de las regiones aguas arriba y aguas abajo de este motivo cinasa para unirse entre sí. Se ha mostrado que la región C-terminal de NIK aguas abajo de su radical cinasa es capaz de unirse directamente a IKKα [Regnier et al. 1997] así... [Seguir leyendo]

1. Un fragmento de polipéptido que se une a cinasa que induce NF-κB (NIK) de la cadena gamma común (cγc) del receptor de IL-2 seleccionado entre el grupo consistente en:

(i) SEQ ID NO: 1 o un fragmento de polipéptido que se une a NIK de la misma;

(ii) una muteína que se une a NIK de un fragmento de polipéptido que se une a NIK de la cγc del receptor de IL-2 de (i) en la que hasta 25% de los residuos de aminoácidos se han delecionado, añadido o sustituido;

(iii) una molécula lineal que se une a NIK permutada circularmente de un fragmento de polipéptido que se une a NIK de la cγc del receptor de IL-2 de (i) ; y

(iv) el fragmento de polipéptido de cγc de SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21.

2. Un polipéptido según la reivindicación 1, que comprende 41MDD tal y como se define en SEQ ID NO: 2.

3. Un polipéptido según la reivindicación 1, que comprende 44MPD tal y como se define en SEQ ID NO: 17.

4. Un ADN que codifica un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o la hebra no codificadora del mismo.

5. Un vector que comprende un ADN según la reivindicación 4.

6. Una célula que comprende un vector según la reivindicación 5.

7. Un método para la producción de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende cultivar la célula según la reivindicación 6 y recoger el polipéptido producido.

8. Un anticuerpo o un fragmento del mismo que reconoce específicamente y se une al polipéptido de SEQ ID NO: 2

o SEQ ID NO: 17 e inhibe las interacciones NIK-cγc.

9. El anticuerpo según la reivindicación 8, que es un anticuerpo policlonal o monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo totalmente humanizado, un anticuerpo anti-Id o un anticuerpo intracelular polipeptídico de la cγc.

10. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el ADN según la reivindicación 4, el vector según la reivindicación 5 o el anticuerpo según la reivindicación 8 o 9.

11. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el ADN según la reivindicación 4, el vector según la reivindicación 5 o el anticuerpo según la reivindicación 8 o 9, para uso en el tratamiento o la prevención de artritis reumatoide y otras artropatías, osteoartritis, enfermedad inflamatoria intestinal, asma, infarto cardíaco, enfermedad de Alzheimer, aterosclerosis, tiroiditis inmune, anemia hemolítica autoinmune o cáncer.

12. El uso de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el ADN según la reivindicación 4, el vector según la reivindicación 5 o el anticuerpo según la reivindicación 8 o 9, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de artritis reumatoide y otras artropatías, osteoartritis, enfermedad inflamatoria intestinal, asma, infarto cardíaco, enfermedad de Alzheimer, aterosclerosis, tiroiditis inmune, anemia hemolítica autoinmune o cáncer.