MAMIFERO NO HUMANO CARENTE DE LA EXPRESION DEL GEN VAV3, PROCEDIMIENTO DE OBTENCION Y SUS APLICACIONES.

Mamífero no humano carente de la expresión del gen Vav3, procedimiento de obtención y sus aplicaciones.

La invención se relaciona con un mamífero no humano knockout útil como modelo experimental cuyo genoma posee el gen Vav3 mutado y cuyos niveles de RNA mensajero o proteína para la proteína Vav3 endógena se encuentran alterados. Otro objeto de la invención lo constituye un procedimiento de obtención de dicho animal no humano, así como una célula eucariota mutada. Este modelo animal o línea celular pueden emplearse en un procedimiento para determinar el efecto de un fármaco útil para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades o trastornos derivados de dicha deficiencia de la proteína Vav3, por ejemplo, problemas de coordinación motora, hipertensión esencial, hiperplasia cardiaca y arterial, taquicardia y esquizofrenia

Mamífero no humano carente de la expresión del gen Vav3, procedimiento de obtención y sus aplicaciones.

Sector de la técnica

Esta invención se refiere a mamíferos en los que se ha suprimido, total o parcialmene, la expresión del gen vav3. Estos animales pueden ser usados para estudiar farmacológica o molecularmente enfermedades de carácter cardiovascular y/o nervioso.

Estado de la técnica

Vav3 es un miembro de la familia de oncoproteínas Vav, la cual presenta representantes en todos los metazoos animales conocidos. En el caso de vertebrados, la familia posee tres miembros (Vav, Vav2 y Vav3) que poseen funciones similares, pero no idénticas. Estas proteínas funcionan como enzimas que catalizan el intercambio de nucleótidos de guanosina sobre las GTPasas de la familia Rho/Rac, un grupo de interruptores moleculares que regulan procesos proliferativos, citoesqueléticos y de forma celular, entre otros. Gracias a su actividad catalítica, las proteínas Vav hacen posible que la activación de estas GTPasas se produzca de una manera rápida y efectiva durante procesos de señalización celular. Las proteínas Vav se regulan durante los procesos de transducción de señales mediante fosforilación directa en tirosinas. Así, estas proteínas son catalíticamente inactivas cuando están en un estado desfosforilado (lo que ocurre en células en reposo). Sin embargo, tras su fosforilación durante procesos de estimulación celular, las proteínas Vav cambian su conformación tridimensional y se activan catalíticamente. Los procesos de fosforilación se realizan a través de tirosín cinasas, las cuales pueden ser transmembrana (como por ejemplo el receptor para el factor de crecimiento epidérmico) o intracelulares (como por ejemplo las cinasas Lck, Syk, Zap70, etc.). El proceso de desfosforilación está llevado a cabo probablemente por tirosín fosfatasas, aunque su identidad permanece todavía por esclarecer. Para una revisión de la función y regulación de estas proteínas, se pueden consular las siguientes publicaciones: Bustelo, Mol. Cell. Biol. 20: 1461-1477 [2000]; Bustelo, Oncogene 20: 6372-6381 [2001]; Bustelo, Front. Biosci. 7: d24-30 [2002]; Turner y Billadeau, Nat. Rev. Immunol. 2: 476-486 [2002].

Las proteínas Vav median diversos procesos celulares. Debido a su acción sobre las GTPasas Rho/Rac, contribuyen a procesos celulares importantes como son la reorganización del citoesqueleto, la activación del ciclo celular, etc. De una manera independiente de las GTPasas Rho/Rac, participan también en otros procesos celulares como la inducción de la expresión de citocinas (vía la activación del factor transcripcional NF-AT). Las proteínas Vav pueden también activar indirectamente otras rutas celulares. Así, vía la estimulación de la fosfolipasa C-gamma, las proteínas Vav pueden activar el factor de intercambio de nucleótidos para Ras conocido por RasGRP1, lo que en última instancia determina la activación de Ras. Esta última ruta ocurre exclusivamente en células linfoides y, probablemente, nerviosas. Para una revisión de los procesos biológicos en que participan estas proteínas, se pueden consultar los siguientes artículos científicos: Bustelo, Mol. Cell. Biol. 20: 1461-1477 [2000]; Bustelo, Oncogene 20: 6372-6381 [2001]; Bustelo, Front. Biosci. 7: d24-30 [2002]; Turner y Billadeau, Nat. Rev. Immunol. 2: 476-486 [2002]; Caloca et al., EMBO J. 22:3326-3336 [2003]; Zugaza et al., Oncogene 23: 5823-33 [2004].

Una de las enfermedades que afectan a un sector amplio de la población mundial son las derivadas de disfunciones del sistema cardiovascular. Así, la hipertensión (presión arterial elevada), afecta a un 25% de la población de sociedades industrializadas. Esta proporción aumenta con el envejecimiento poblacional, alcanzando valores del 60-70% en individuos mayores de 70 años. Esta enfermedad es un factor de riesgo para muchas causas de morbilidad y mortalidad, como son los infartos de miocardio, fallo cardiaco congestivo, enfermedades renales y ataques cerebrales. Además, generalmente va asociada a otras disfunciones del organismo, como son la obesidad abdominal, la dislipidemia, la intolerancia a glucosa, la hiperinsulinemia y la hiperuriquemia. A pesar de su importancia poblacional, todavía permanecen por esclarecer las causas moleculares que determinan la aparición de problemas en el sistema cardiovascular. Así, mientras que un 5% de casos se ha asociado a alguna disfunción genética, en el 95% de los casos (pacientes con la denominada "hipertensión esencial") la causa está todavía por definir. En todo caso, siempre se ha sospechado que uno de los problemas de la la hipertensión esencial es el mal funcionamiento del sistema nervioso simpático, una parte del sistema nervioso que, entre otras funciones, tiene el papel de regular el ritmo cardiaco y la contracción del sistema vascular. Para revisiones sobre el tema, consúltense la siguientes referencias científicas: Lifton et al., Cell 104: 545-556 [2001]; Staesen et al., The Lancet 361: 1629-1641 [2003]; Takahashi y Smithies, Trends in Genetics 20: 136-145 [2004].

El circuito fisiológico que determina el control del ritmo cardiaco y presión arterial se conoce relativamente bien. Se sabe que existen hormonas que provocan tanto la vasoconstricción (angiotensina II) como la vasodilatación (bradiquinina). Los procesos moleculares y las rutas de señalización activadas por estas hormonas están también relativamente bien explorados. Para una revisión del campo, consultar las siguientes publicaciones científicas: Lifton et al., Cell 104: 545-556 [2001]; Staesen et al., The Lancet 361: 1629-1641 [2003]; Takahashi et al., Endocrinology 144: 2184-2190 [2003]; Takahashi y Smithies, Trends in Genetics 20: 136-145 [2004].

Dada la importancia de la enfermedad cardiovascular en la población humana, existe un gran interés en desarrollar modelos animales que permitan reproducir la totalidad o parte de dicha enfermedad. Para este fin, se han preparado diferentes mamíferos que tienen niveles alterados de la expresión de ciertos genes. Una clase de estos mamíferos son los llamados mamíferos transgénicos. Estos mamíferos tienen un gen o genes nuevos introducidos en su genoma, lo que resulta en la sobreexpresión de las proteínas codificadas por aquéllos. Otra clase de estos mamíferos son los llamados mamíferos "knockout", en los que se ha suprimido la expresión de un gen endógeno por manipulación genética (lo que resulta en la eliminación de dicha proteína del organismo del mamífero). Como consecuencia de ello, existen ahora modelos animales con diversos parámetros del sistema cardiovascular alterados. Entre éstos se encuentran animales que sobreexpresan la enzima convertidora de la angiotensina (un enzima que provoca la formación de angiotensina II a partir de la molécula intermediaria angiotensina I), el angiotensinógeno (el precursor de la angiotensina I y II) y de la propia angiotensina II. Entre los animales knockout destaca el de la renina (un enzima que corta el angiotensinógeno para dar la angiotensina I), el de los receptores de la angiotensina II (receptores AT1_a y AT1_b) y el del receptor de la bradiquinina (B2). Aunque estos mamíferos manifiestan alteraciones en el sistema cardiovascular, su uso es limitado puesto que derivan de la alteración de genes que, en condiciones normales, no están alterados de manera causativa en la hipertensión esencial. Para revisiones científicas sobre este tema, consulténse los siguientes artículos científicos: Carmeliet y Collen, J. Pathol. 190: 387-405 [2000]; Lifton et al., Cell 104: 545-556 [2001]; Brede y Hein, Regulatory Peptides 96: 125-132 [2001]; Takahashi y Smithies, Trends in Genetics 20: 136-145 [2004].

Junto con los estudios en animales, otra área de investigación activa es el uso de células aisladas en cultivos celulares. En este caso, destaca el estudio de las células de músculo liso de diversos conductos vasculares. Estas células se han estudiado para elucidar las rutas de señalización utilizadas por las hormonas que regulan la presión arterial. En todo caso, su uso es más limitado que el de los modelos animales puesto que los parámetros experimentales que pueden ser estudiados en cultivos celulares son menores que los modelos animales.

Como se ha dicho anteriormente, la manipulación genética de mamíferos...

1. Mamífero no humano knockout útil como modelo experimental caracterizado porque su genoma posee el gen vav3 mutado.

2. Mamífero no humano según la reivindicación 1 caracterizado porque es un ratón knockout mutante deficiente en la proteína Vav3 endógena.

3. Mamífero no humano según la reivindicación 2 caracterizado porque es un ratón que contiene una deleción dentro de la región 5' del gen vav3 (zona promotora y parte de exón 1 (SEQ ID NO5) que conlleva la inactivación del gen vav3 endógeno y al ausencia de expresión de la proteína codificada por éste.

4. Mamífero no humano según la reivindicación 1 caracterizado porque es un mutante heterocigoto para la mutación vav3.

5. Mamífero no humano según la reivindicación 1 caracterizado porque es un mutante homocigoto para la mutación vav3.

6. Procedimiento de obtención del mamífero no humano según las reivindicaciones 1 a la 5 caracterizado porque permite la anulación funcional de la proteína Vav3 en las células germinales y/o somáticas de dicho animal y porque se realiza por recombinación homóloga del gen vav3 que comprende las siguientes etapas:

        a)        elaboración de una construcción knockout de recombinación homóloga vav3 con selección positiva que comprende unas regiones de homología con sendas secuencias de nucleótidos presentes en dicho gen vav3 endógeno,

        b)        transformación de una célula con la construcción knockout de a),

        c)        selección de los homólogos recombinantes mediante la técnica de selección positiva, y

        d)        las células con la construcción insertada se introducen en embriones que posteriormente son implantados en hembras receptoras para su adecuada gestación, dejándose que se desarrollen a término seguidamente.

7. Procedimiento según la reivindicación 6 caracterizado porque la construcción knockout de recombinación homóloga vav3 de a) es una secuencia de ácido nucleico que comprende:

        (i)        una secuencia de ácido nucleico de una parte del gen vav3,

        (ii)        una secuencia marcadora empleada para detectar la presencia de la construcción knockout en la célula transfectada, y

        (iii)        la presencia de "brazos" con secuencias nucleotídicas idénticas al gen endógeno con el fin de facilitar la recombinación homologa del vector knockout con el gen endógeno.

8. Procedimiento según la reivindicación 7 caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico de una parte del gen vav3 de (i) comprende:

        a)        una secuencia total o parcial de uno o más exones y/o intrones del gen vav3,

        b)        una secuencia promotora total o parcial del gen vav3,

        c)        cualquiera de sus combinaciones, o

        d)        una secuencia de cDNA de vav3.

9. Procedimiento según la reivindicación 8 caracterizada porque la secuencia de ácido nucleico de una parte del gen vav3 de la construcción knockout de (i) es una cualquiera de las formas homólogas del gen vav3 existentes en un mamífero no humano

10. Procedimiento según la reivindicación 6 caracterizado porque la célula transformada de b) es una célula madre embrionaria (ES).

11. Procedimiento según la reivindicación 6 caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico de una parte del gen vav3 murino (i) de la construcción knockout vav3 de a) es la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO5, aislada del ratón 129 SvJ, constituida por una parte de la secuencia de nucleótidos del promotor, el exón 1 y parte del intrón 1 del gen vav3 murino y porque la célula transformada de b) es una celular embrionaria (ES) de ratón.

12. Construcción knockout de recombinación homóloga vav3 caracterizada porque es uña secuencia de ácido nucleico diseñada para disminuir o suprimir la expresión de la proteína vav3 codificada por secuencias de DNA endógeno en una célula y comprende:

        (i)        una secuencia de ácido nucleico de una parte del gen vav3,

        (ii)        una secuencia marcadora empleada para detectar la presencia de la construcción knockout en la célula transfectada, y

        (iii)        la presencia de "brazos" con secuencias nucleotídicas idénticas al gen endógeno con el fin de facilitar la recombinación homologa del vector knockout con el gen endógeno.

13. Construcción knockout de recombinación homóloga vav3 según la reivindicación 12 caracterizada porque la secuencia de ácido nucleico de una parte del gen vav3 (i) comprende:

        a)        una secuencia total o parcial de uno o más exones y/o intrones del gen vav3,

        b)        una secuencia promotora total o parcial del gen vav3,

        c)        cualquiera de sus combinaciones, o

        d)        una secuencia de cDNA de vav3.

14. Construcción knockout de recombinación homóloga vav3 según la reivindicación 13 caracterizada porque la secuencia de ácido nucleico de una parte del gen vav3 de la construcción knockout de (i) es una cualquiera de las formas homólogas del gen vav3 existentes en un mamífero no humano.

15. Construcción knockout de recombinación homóloga vav3 según la reivindicación 12 caracterizada porque la secuencia de ácido nucleico de una parte del gen vav3 (i) es la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO5 que está constituida por una parte de la secuencia de nucleótidos del promotor, el exón 1 y parte del intrón 1 del gen vav3 murino.

16. Vector de clonación, caracterizado porque comprende la construcción knockout vav3 según las reivindicaciones 12 a la 15.

17. Célula eucariota no humana mutada caracterizada porque presenta una disrupción del gen vav3 endógeno y una deficiencia, parcial o total, en la expresión de la proteína Vav3.

18. Célula eucariota según la reivindicación 17 caracterizada porque es una célula pluripotente indiferenciada establecida a partir de la masa interna celular de un embrión knockout en la fase preimplantatoria denominada blastocisto.

19. Célula eucariota según la reivindicación 17 caracterizada porque es una célula diferenciada.

20. Célula eucariota según la reivindicación 19 caracterizada porque la célula diferenciada es aislada a partir de un mamífero knockout no humano según las reivindicaciones 1 a la 5.

21. Célula eucariota según la reivindicación 20 caracterizada porque la célula diferenciada proviene de una línea celular.

22. Célula eucariota según las reivindicaciones 19 a la 21 caracterizada porque es una célula diferenciada perteneciente a una estirpe del siguiente grupo: células del sistema nervioso y del sistema cardiovascular.

23. Célula eucariota según las reivindicaciones 17 a la 22 caracterizada porque es heterocigota u homocigota.

24. Procedimiento de obtención de la célula eucariota según las reivindicaciones 17 a la 23 caracterizado porque es un procedimiento de transgénesis de anulación de la actividad funcional del gen vav3 que comprende la transformación de dicha célula eucariota mediante la introducción de una construcción génica que comprende un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos codifica un elemento inhibidor de la expresión del gen vav3 capaz de anular su actividad biológica, seleccionándose dicho elemento inhibidor entre:

        a)        una secuencia de nucleótidos antisentido especifica de la secuencia del gen o del mRNA de la proteína Vav3,

        b)        una ribozima específica del mRNA de la proteína Vav3,

        c)        un aptámero específico del mRNA de la proteína Vav3, y

        d)        un RNA pequeño de interferencia (siRNA) específico del mRNA de la proteína Vav3.

25. Empleo del mamífero no humano según la reivindicación 1 a la 5 ó de la célula según la reivindicación 17 a la 23 en un procedimiento para determinar el efecto de un fármaco o combinación de fármacos útiles para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades o transtornos derivados de la deficiencia de la proteína Vav3.

26. Empleo según la reivindicación 25 caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

        a)        administración del fármaco o fármacos en forma y dosis adecuada al animal knockout no humano de la invención o a la célula knockout no humano de la invención in vitro, y

        b)        determinación de su efecto sobre un parámetro indicativo de dicha deficiencia de Vav3.

27. Empleo según la reivindicación 25 caracterizado porque los fármacos son útiles para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad perteneciente al siguiente grupo: hipertensión esencial o de base genética, hiperplasia cardiaca o arterial, procesos nerviosos, como por ejemplo la enfermedad de Parkinson, procesos neurodegenerativos motores, y esquizofrenia.

28. Empleo según la reivindicación 26 caracterizado porque la determinación del efecto de los fármacos ensayados b) se realiza sobre un parámetro indicativo de dicha deficiencia de Vav3 perteneciente al siguiente grupo: niveles de presión arterial, ritmo cardiaco, histología del sistema nervioso y cardiovascular, niveles de moléculas reguladoras del estado cardiovascular (por ejemplo, angiotensina II, bradiquinina, así como sus reguladores biosintéticos y receptores), de neurotransmisores del sistema nervioso simpático (diversos tipos de catecolaminas), de moléculas que intervienen en la regulación del sistema nervioso simpático (por ejemplo, GAD65, GAT1, TH, GABA, glutamato) y cardiovascular (marcadores intracelulares, transmembranarias y extracelulares producidas por las células vasculares del músculo liso).

29. Empleo según la reivindicación 25 caracterizado porque el animal es un roedor o un primate no humano.

30. Empleo según la reivindicación 25 caracterizado porque la línea celular es una línea derivada del sistema nervioso y/o cardiovascular.