Árboles transgénicos resistentes a explosivos y que eliminan TNT.

El objetivo de la presente patente es aportar una alternativa económica y respetuosa con el medio ambiente para eliminar compuestos nitroaromáticos, preferentemente 2,4,6-trinitrotolueno (TNT) de suelos y aguas subterráneas. Para ello se utilizan plantas transgénicas que eliminan estos compuestos. El método incluye el uso de chopos y abedules transgénicos portando los genes pnrA, xenB o nemA de Pseudomonas putida o el gen nemA de Escherichia coli expresados desde el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV35S) que es constitutivo en plantas. La expresión de estos genes confiere a los árboles mayor resistencia a TNT e incrementa la capacidad para eliminar TNT de suelos y aguas subterráneas. La limpieza de los sitios contaminados pueden realizarla las plantas transgénicas cultivándolas en los suelos contaminados o en suelos próximos a acuíferos contaminados. Las plantas extraen TNT y lo detoxifican. Estas plantas transgénicas pueden restaurar sitios altamente contaminados, y así permitir la recolonización del suelo limpio por plantas autóctonas que no verían inhibido su crecimiento debido a la eliminación del contaminante

Árboles transgénicos resistentes a explosivos y que eliminan TNT.

Sector de la técnica

La invención se encuadra en el sector de la lucha biológica contra la contaminación química generada por la fabricación de productos con aplicaciones en el área de los explosivos y productos farmacéuticos de carácter nitroorgánico. La invención hace uso de técnicas agrícolas para facilitar la eliminación de productos recalcitrantes de aguas subterráneas y el subsuelo.

Estado de la técnica

El 2,4,6-trinitrotolueno (TNT) se utiliza ampliamente en explosivos civiles y militares en el mundo. Su síntesis, procesamiento, almacenamiento y eliminación ha dado lugar a la contaminación de suelos, aguas superficiales y aguas subterráneas. Se sabe que existen grandes extensiones de suelo contaminado por TNT en USA y Europa que necesitan tratamiento. Gran parte de los residuos de TNT se han depositado en lagunas sin revestimientos, alcanzando las aguas subterráneas por filtración (Pennington y Patrick, 1990. Adsorption and desorption of 2,4,6-trinitrotoluene by soils. J. Environ. Qual. 195:559-567; Selim et al., 1995. Transport of 2,4,6-trinitrotoluene and hexahydro-1,3,4-trinitro-1,3,5-triazine in soils. Soil Sci. 160:328-339). El TNT es tóxico para numerosos procariotas y eucariotas y mutagénico en Salmonella typhimurium (Spanggord et al., 1982. Mutagenicity in Salmonella typhimurium and strucutre activity relationships of waste water components emanating from the manufacture of trinitrotoluene. Environ. Mutagen. 4:163-179; Styles y Cross, 1983. Activity of 2,4,6,-TNT in an in vitro mammalian gene mutation assay. Cancer Lett. 20:103-108; Tan et al., 1992. Mutagenicity of trinitrotoluene and its metabolites formed during composting. J. Toxicol. Environ. Health 36:165-175; Won y Disalvo, 1976. Toxicity and mutagenicity of 2,4,6-trinitrotoluene and its microbial metabolites. Appl. Environ. Microbiol. 31:576-580; J.C.S. Spain, J.B. Huger y H.J. Knackmuss, (Eds). Biodegradation of nitroaromatic compounds and explosives. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA) debido a la naturaleza electrofílica del anillo aromático. De hecho el TNT oxida reductores originando toxicidad directamente o a través de la formación de otros productos como radicales nitroareno (Mason y Josephy, 1985, Toxicity of nitroaromatic compounds, Hemisphere Publishing Co. New Cork pp. 121-140). El TNT por su naturaleza de nitroaromático es un xenobiótico que, debido a su toxicidad, su eliminación se considera una prioridad por diversas agencias medioambientales.

Hasta la fecha, la tecnología que se ha utilizado para tratar los suelos contaminados es la retirada de los mismos y su incineración. Aunque la incineración es altamente efectiva, tiene las desventajas de su alto coste y la generación de gases de efecto invernadero que además afectan a la capa de ozono. Tratamientos alternativos ex situ incluyen compostaje, "land-farming", y tratamiento de suelos en biorreactores. En estos biorreactores el TNT se transforma y sus derivados se unen irreversiblemente a las partículas del suelo, lo cual neutraliza su toxicidad. Sin embargo, en suelos profundos contaminados con TNT estas tecnologías ex situ son difíciles de aplicar. Es por ello que se necesitan métodos alternativos menos onerosos. La biorremediación ofrece el potencial que requiere dicha alternativa.

Se han descrito microorganismos que eliminan TNT disuelto en agua y que operan con una alta eficacia (Duque et al., 1993. Construction of a Pseudomonas hybrid strain that mineralizes 2,4,6-trinitrotoluene., J. Bacteriol. 175:2278-2283; Esteve-Núñez et al., 1998. Metabolism of 2,4,6-Trinitrotoluene by Pseudomonas sp. JLR11. Environ. Sci. Tech. 32: 3802-3808). Sin embargo cuando estos microorganismos se introducen en suelos desnudos, su viabilidad se ve disminuida y son poco eficientes eliminado el contaminante. Una estrategia alternativa consiste en introducir los microorganismos adheridos a la semilla de plantas, así se consiguen altas densidades celulares, pero los microorganismos aerobios sólo funcionan en la capa superior de los suelos. Otra estrategia alternativa es la de transferir a plantas genes bacterianos que atacan al TNT y facilitar así la eliminación de TNT en suelos tanto superficiales como profundos. Para esta aproximación se ha elegido chopos híbridos Populus tremula x Populus tremuloides var. Etropole (chopo) y Betula pendula (abedul) como plantas vector, y los genes pnrA, xenB y nemA de P. putida cepa JLR11 y el gen nemA de Escherichia coli, todos estos genes codifican enzimas que desactivan el anillo de TNT.

La presente invención describe un método para la generación de árboles transgénicos caracterizados por tener mayor resistencia a TNT debido a que expresan los genes bacterianos pnrA, xenB o nemA de P. putida o nemA de Escherichia coli. Los árboles obtenidos por este método se caracterizan porque en suelos con TNT tienen mayor peso, contenido en proteína, clorofila en las hojas y mayor crecimiento vegetativo, tanto en altura como en el número de hojas, que los árboles no transformados. Por tanto, esta invención provee un método eficaz para eliminar de los suelos explosivos y, específicamente, explosivos nitroaromáticos.

La persistencia y toxicidad de TNT se debe en gran medida a su estructura química, que limita el ataque oxidativo de la molécula por oxigenasas. De hecho la mineralización (conversión de un compuesto a CO₂ y agua) del TNT bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas es limitada (Funck et al., 1995, en: Bioremediation of recalcitrant organics, Battelle Press: Columbus, OH pp. 329-350; Fernando et al., 1990. Biodegradation of TNT (2,6-trinitrotoluene) by Phanerochaete chrysosporium. Appl. Environ. Microbiol. 47:452-457; Scheibner et al., 1997. Screening for fungi intensively mineralizing 2,4,6-trinitrotoluene. Appl. Microbiol. Biotechnol. 47:452-457; Herre et al., 1997. Fourth internacional in situ and on site bioremediation symposium, Battelle Press: Columbus, OH vol. 2, pp. 493-498; Widrig et al., 1997. Bioremediation of TNT-contaminated soil: a laboratory study. Environ. Toxicol. Chem. 16:1141-1148; Boopathy et al., 1998. A laboratory study of the bioremediation of 2,4,6-trinitrotoluene-contaminated soil using aerobic/anoxic soil slurry reactor. Water Environ. Res. 70:80-86; Duque et al., 1993. Construction of a Pseudomonas hybrid strain that mineralizes 2,4,6- trinitrotoluene, J. Bacteriol. 175:2278-2283). Sin embargo, se han descrito bacterias que utilizan TNT como fuente de nitrógeno. Por otro lado, se debe indicar que los grupos nitro del anillo aromático son fácilmente reducibles por reductasas que están ampliamente distribuidas entre los seres vivos. La reducción de los grupos nitro ocurre en una serie de transferencia de dos electrones que conduce a la formación de derivados nitroso, hidroxilamino y amino. Los derivados hidroxilamino se han identificado recientemente como intermediarios en la degradación de nitroaromáticos, y pueden dar lugar tras reorganizaciones de tipo Bamberger a la producción de amonio. No obstante, bajo condiciones aeróbicas, pero no en anaeróbicas, los derivados nitroso e hidroxilamino pueden reaccionar entre ellos dando lugar a la producción de tetranitroazoxitoluenos, que son muy recalcitrantes (Haïdour y Ramos, 1996. Identification of products resulting from the biological reduction of 2,4,6-trinitrotoluene, 2,4-dinitrotoluene, and 2,6-dinitrotoluene by Pseudomonas sp., Environ. Sci. Technol. 30:2365-2370).

Se ha aislado una bacteria identificada como Pseudomonas sp. JLR11 capaz de utilizar TNT como fuente de nitrógeno bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas. Balances de masa con TNT revelaron que alrededor de un 85% del total del nitrógeno del TNT se incorporaba a la célula como biomasa (Esteve-Núñez y Ramos, 1998. Metabolism of 2,4,6-trinitrotoluene by Pseudomonas sp. JLR11. Environ. Sci. Technol. 32:3802-3808). Esta cepa también utiliza TNT como aceptor final de electrones, indicando que la cepa respira TNT (Esteve-Núñez et al. 2000. Respiration of 2,4,6-trinitrotoluene by Pseudomonas sp. strain JLR11. J. Bacteriol. 182:1352-1355). Recientemente se ha identificado que la proteína PnrA (GenBank AAM95986) de esta cepa es una nitroreductasa citoplasmática que reduce TNT a 4-hidroxilamino-2,6-dinitrotolueno (A. Caballero et al....

1. Planta resistente a compuestos nitroaromáticos caracterizada porque incluye al menos un gen derivado o modificado de Pseudomonas putida JLR11 o de Escherichia coli.

2. Planta resistente a compuestos nitroaromáticos según la reivindicación 1 caracterizada porque los genes procedentes de P. putida JLR11 se seleccionan entre xenB (SEQ ID Nº 9), pnrA (SEQ ID Nº 10) y nemA (SEQ ID Nº 11).

3. Planta resistente a compuestos nitroaromáticos según la reivindicación 1 caracterizada porque el gen procedente de E. coli es nemA (SEQ ID Nº 12).

4. Planta resistente a compuestos nitroaromáticos caracterizada porque los genes derivados de P. putida y E. coli presentan una secuencia codificadora al menos un 70% idéntica a los genes de las reivindicaciones 2 y 3, implicando cualquier adición múltiple o individual de nucleótidos, sustituciones o eliminaciones.

5. Planta resistente a compuestos nitroaromáticos según las reivindicaciones 1-4 caracterizada porque en los genes modificados de P. putida y E. coli se ha sustituido la secuencia del promotor bacteriano por otra que garantice la expresión en planta.

6. Planta resistente a compuestos nitroaromáticos según las reivindicaciones 1-5 caracterizada porque los genes bacterianos tienen actividad metabólica en condiciones aeróbicas y anaeróbicas, y las proteínas expresadas en los explantes son activas en condiciones de alta y baja tensión de oxigeno tanto en suelos como en aguas subterráneas.

7. Planta resistente a compuestos nitroaromáticos según las reivindicaciones 1-6 caracterizada porque es una planta leñosa, preferentemente un árbol, y más preferentemente un árbol que pertenece a los géneros Populus y Betula o híbridos de los mismos.

8. Planta resistente a compuestos nitroaromáticos según las reivindicaciones 1-7 caracterizada porque dicha planta es resistente preferentemente al explosivo 2,4,6-trinitrotolueno o productos de su degradación tales como derivados nitroso, amino, hidroxilamino, dinitrotoluenos y nitrotoluenos.

9. Planta resistente a compuestos nitroaromáticos según las reivindicaciones 1-8 caracterizada porque dichas plantas presentan mayor peso, mayor contenido en proteína y clorofila en las hojas y mayor crecimiento vegetativo que las plantas de la misma especie no transformadas.

10. Procedimiento de obtención de plantas resistentes a compuestos nitroaromáticos según las reivindicaciones 1-9 caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

11. Utilización de una planta resistente a compuestos nitroaromáticos según las reivindicaciones 1-9 para fitorremediar un suelo o agua subterránea contaminados por compuestos nitroaromáticos.

12. Utilización de una planta resistente a compuestos nitroaromáticos según la reivindicación 11 caracterizada porque el término "fitorremediar" comprende los procesos de fitoextracción, fitodegradación, fitodetoxificación, fitocontención y rizodegradación de los compuestos nitroaromáticos.

13. Utilización de una planta resistente a compuestos nitroaromáticos según las reivindicaciones 11 y 12 caracterizada porque dichos compuestos nitroaromáticos son preferentemente TNT y sus productos de degradación (derivados nitroso, amino, hidroxilamino, dinitrotoluenos y nitrotoluenos).

14. Utilización de una planta resistente a compuestos nitroaromáticos según las reivindicaciones 1-9, para la restauración de los ecosistemas de zonas contaminadas por compuestos nitroaromáticos.

15. Utilización de una planta resistente a compuestos nitroaromáticos según las reivindicaciones 1-9 como barrera que impide el avance de los contaminantes.

16. Utilización de una planta resistente a compuestos nitroaromáticos según las reivindicaciones 1-9 para estimular el crecimiento de las bacterias que colonizan la rizosfera y son capaces de degradar compuestos nitroaromáticos, estimulando la rizorremediación.

17. Utilización de una planta resistente a compuestos nitroaromáticos según las reivindicaciones 11-16 caracterizada porque el suelo a descontaminar está próximo a una instalación productora de dichos compuestos nitroaromáticos.

18. Utilización de una planta resistente a compuestos nitroaromáticos según las reivindicaciones 11-14 caracterizada porque el agua subterránea a tratar es un efluente procedente de una fábrica de explosivos.

19. Utilización de una planta resistente a compuestos nitroaromáticos según las reivindicaciones 11-14 caracterizada porque el agua subterránea a tratar resulta de la percolación de polvorines.

20. Procedimiento de utilización de una planta resistente a compuestos nitroaromáticos según las reivindicaciones 11-17 caracterizado porque comprende las etapas de: