Microorganismo productor de anticuerpos, elementos necesarios para su obtención,

anticuerpos así producidos, composiciones terapéuticas y sus aplicaciones.

La presente invención describe un microorganismo productor, secretor e inyector de anticuerpos recombinantes monodominio en células eucariotas, animales o plantas, gracias a la presencia de una construcción genética que contiene una señal de secreción de tipo III. Además, estos microorganismos no patógenos o atenuados pueden utilizarse en la elaboración de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades humanas o veterinarias

Microorganismo productor de anticuerpos, elementos necesarios para su obtención, anticuerpos así producidos, composiciones terapéuticas y sus aplicaciones.

Sector de la técnica

La presente invención se enmarca en el campo de la biotecnología, más concretamente en el campo de producción de anticuerpos, microorganismos productores de anticuerpos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades humanas o veterinarias.

Estado de la técnica

La posibilidad de expresar y seleccionar moléculas de anticuerpo en bacterias, especialmente en Escherichia coli y sus bacteriófagos ha atraído la atención de la biotecnología en las últimas décadas^1,2 y ha aumentado enormemente el potencial biotecnológico de los anticuerpos para su utilización en procesos de diagnóstico y terapia frente a múltiples enfermedades, como el cáncer o enfermedades autoinmunes^3,4. Los denominados anticuerpos recombinantes, producidos en bacterias por técnicas de ingeniería genética, son pequeños fragmentos derivados de las moléculas completas de anticuerpo (e.g. IgGs) que mantienen la capacidad de unión al antígeno^1,5. Estos fragmentos de anticuerpos conservan siempre al menos uno de los dominios variables (V) de las inmunoglobulinas (Igs), donde reside la unión al antígeno, y en ocasiones tienen además algún(os) dominios constantes (C) donde residen otras funciones de los anticuerpos (p.ej. activación del complemento). Así, aunque existen múltiples formatos de anticuerpos recombinantes, todos ellos tienen como unidad mínima común un dominio V con capacidad de unión al antígeno. De esta manera, y basándonos sólo en criterios estructurales, los anticuerpos recombinantes pueden ser clasificados al menos en tres tipos básicos: anticuerpos monodominio (domain antibodies, dAbs; si sólo contienen un dominio V)⁶, monocadena Fv (o single chain Fv, scFv; si contienen los dominios V de las cadenas pesada -VH- y ligera -VL- conectados a través de un pequeño péptido fléxible) y fragmentos Fab (antigen binding fragment, Fab, formados por dos cadenas polipeptídicas, una conteniendo los dominios VH-CH1 y la otra los dominios VL-CL. Posteriormente, mediante combinaciones de dos, tres o cuatro (o más) de estas unidades básicas, ya sean dAbs, scFvs, o Fabs, se obtienen los diabodies, triabodies o tetrabodies, que son moléculas de mayor afinidad (avidez) por el antígeno por disponer de repeticiones del sitio de unión¹. Además, si se adicionan distintos dominios C a estas moléculas, se puede obtener toda una diversidad de moléculas de anticuerpos recombinantes conocidas colectivamente como minibodies⁷. En todos los casos, como se ha explicado antes, los distintos formatos de anticuerpos recombinantes siempre tienen como unidad común básica al menos un dominio V con capacidad de unión a un antígeno determinado.

Estos domain antibodies dAb⁴ mantienen la capacidad de unión a antígeno y son dominios V que derivan tanto de anticuerpos naturales "estándar" (con cadenas pesadas y ligeras, como los encontrados en el hombre, el ratón, o el conejo) como de anticuerpos naturales con únicamente cadenas pesadas (o heavy chain antibodies), como los producidos por la familia de los camélidos (e.g. camellos, llamas y vicuñas)⁶ o los dominios IgNAR de escualos (p. ej. tiburones nodriza)¹¹. Así, los dAbs pueden ser dominios V de cadenas ligeras (VL) o dominios V de cadenas pesadas (VH), ya sean de anticuerpos estándar o de anticuerpos de sólo cadenas pesadas (VHH, heavy chain only VH). El pequeño tamaño de estos anticuerpos recombinantes dAb, su escasa inmunogenicidad y rechazo en humanos, su facilidad de expresión en bacterias y levaduras a altas concentraciones, y su características bioquímicas de estabilidad a agentes desnaturalizantes y solubilidad, han suscitado el interés de la comunidad científica y del sector biotecnológico y farmacéutico^4,12. De hecho, diversas empresas han centrado su actividad exclusivamente en las aplicaciones biotecnológicas de los dAb, como por ejemplo Domantis (http://www.domantis.com/) o Ablynx (http://www.ablynx.com/) y tienen patentes exclusivas sobre los dAbs.

Por otro lado, existen sistemas de inyección de proteínas desde una bacteria a una célula eucariótica, como por ejemplo los sistemas de secreción de proteínas tipo III (SST3). Los SST3 son responsables de la inyección al citoplasma de una célula eucariótica de determinadas proteínas bacterianas que participan en el desarrollo de la infección^15,16 Las proteínas naturales inyectadas por los sistemas SST3, también llamadas proteínas efectoras, suelen ser toxinas que alteran el metabolismo de la célula eucariótica. Existen SST3 homólogos a los de E. coli EPEC y EHEC empleados en esta invención en múltiples cepas de bacterias Gram negativas patógenas de animales (p.ej. Salmonella enterica, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia pestis, Pseudomonas aeruginosa, Shigella flexnerii, Citrobacter rodentium) y de plantas (Pseudomonas syringae, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris, Erwinia amylovora, etc.). Los SST3 son sistemas complejos y están constituidos por más de 20 proteínas distintas que ensamblan una superestructura molecular conocida como complejo de aguja (needle complex) o inyectisoma (injectisome) que atraviesa las membranas interna y externa de las bacterias gram negativas formando una estructura en forma de jeringa especializada en la secreción e inyección de proteínas^15,16. En las cepas EPEC y EHEC los componentes más destacables del complejo de la aguja son la proteína EscF, la proteína EscC -que forma un canal hidrófílico en la membrana externa bacteriana- y la proteína EscN, que es una ATPasa esencial para el proceso de secreción localizada en la base de la aguja¹⁷. Otros componentes estructurales de la aguja en EPEC y EHEC son los productos de los genes escR escS escT escU escD escJ escV y sepQ, entre otros. Además del complejo de la aguja, la inyección de proteínas a la célula eucariótica por la maquinaria SST3 precisa de un grupo de proteínas llamadas "translocadoras" (translocators) que forman un canal en la membrana plasmática de la célula eucariótica. Estas proteínas translocadoras suelen ser secretadas por los propios SST3^15,16. De acuerdo con este modelo, se ha observado que cepas mutantes en las proteínas translocadoras son capaces de secretar los efectores al medio pero no de inyectarlos a la célula eucariótica. En las cepas EPEC y EHEC las proteínas translocadoras son EspB y EspD. Además, en los SST3 de EPEC y EHEC, la proteína EspA (también translocada por el SST3) forma un filamento que se extiende más allá de la aguja (EscF) hasta el poro de translocación formado por EspB/D¹⁷.

Los componentes de los SST3 se ensamblan de manera secuencial^15,16, así las primeras en ensamblarse son los anillos que se encuentran en las membranas interna y externa de la bacteria (EscV y EscC, interior y exterior respectivamente), entre estas dos proteínas una tercera actúa de puente (EscJ), de manera que la proteína que atraviesa el sistema no tenga ningún contacto con el espacio periplásmico. A continuación, se ensamblan las proteínas de la aguja (EscF), los filamentos de EspA y, finalmente, las proteínas translocadoras EspD y EspB^17,18.

Los SST3 se han empleado con anterioridad a esta invención dentro del campo de la generación de vacunas vivas basadas en cepas bacterianas atenuadas. Así, se han inyectado distintos antígenos (bacterianos, virales o tumorales) desde cepas atenuadas bacterianas (derivadas de Salmonella enterica o Yersinia enterocolitica) para que indujesen una respuesta inmune en el hospedador frente al antígeno/s inyectados^19-27. Por ejemplo, se han empleado cepas atenuadas de Salmonella enterica para la inyección de antígeno Gag del virus HIV-1²⁸ o el antígeno tumoral NY-ESO-1²⁹.

Las cepas EPEC y EHEC empleadas en esta invención, son enteropatógenos que desarrollan la infección a través de una unión fuerte a las células del epitelio intestinal (enterocitos) llamada lesión de adhesión y barrido (attaching and effacing A/E lesion)¹⁸. La capacidad de unión íntima a la membrana plasmática del enterocito está mediada por una adhesina bacteriana llamada Intimina (eaeA), localizada en la membrana externa de la bacteria, que interacciona con un receptor llamado Tir (translocated intimin receptor)...

1. Microorganismo caracterizado porque presenta un sistema de secreción e inyección de proteínas tipo III (SST3) útil para la secreción extracelular y/o inyección de anticuerpos funcionalmente activos en células eucariotas y una construcción genética que comprende, al menos, una secuencia de ADN que contiene la secuencia codificante de la región señal de secreción (SS)SEC ID NO5, reconocida por un sistema SST3, unida o fusionada a una secuencia de ADN que contiene la secuencia codificante de un anticuerpo y que permite la expresión de dicho anticuerpo de fusión funcionalmente activo en su citoplasma y su secreción o inyección exterior.

2. Microorganismo según la reivindicación 1 donde dicho microorganismo es una bacteria Gram negativa.

3. Microorganismo según la reivindicación 2 donde la bacteria Gram negativa es una cepa de Escherichia coli enteropatógena (EPEC) y/o enterohemorrágica (EHEC).

4. Microorganismo según la reivindicación 1 donde el anticuerpo funcionalmente activo es un anticuerpo recombinante o minianticuerpo que mantiene al menos un dominio variable de inmunoglobulina donde residen las zonas de unión a antígenos, y que pertenece al siguiente grupo: Fab, F(ab')2, scFv, y anticuerpos recombinantes monodominio (dAbs).

5. Microorganismo según la reivindicación 4 donde el anticuerpo recombinante monodominio está constituido por un dominio variable de cadena pesada (VH), dominio variable de cadena ligera (VL), o sea un anticuerpo recombinante de camélidos (VHH), un anticuerpo recombinante de camélidos humanizados, un anticuerpo recombinante de otras especies camelizados, un anticuerpo monodominio IgNAR de peces cartilaginosos.

6. Microorganismo según la reivindicación 1 donde la secuencia de ADN codificante del anticuerpo es un anticuerpo monodominio dAb, preferentemente de tipo V_HH.

7. Construcción genética caracterizada porque comprende, al menos:

y porque permite la expresión del anticuerpo de fusión en la célula.

8. Construcción genética según la reivindicación 7 donde secuencia codificante del anticuerpo de interés codifica para un anticuerpo de camélido, y más preferentemente es una secuencia que comprende cualquiera de las siguientes:

9. Anticuerpo de fusión caracterizado porque comprende cualquiera de estas secuencias:

10. Vector de expresión o plásmido que comprende la construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 7-8.

11. Uso de la construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 7-8 o del vector de expresión según la reivindicación 10 para la obtención del microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

12. Procedimiento de obtención del microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 caracterizado porque comprende al menos la transfección o transformación del microorganismo con la construcción genética según las reivindicaciones 7-8 o con el vector de expresión según la reivindicación 10.

13. Uso del microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en un procedimiento biotecnológico de secreción y/o inyección de anticuerpos recombinantes funcionales de interés.

14. Uso del microorganismo según la reivindicación 13 caracterizado porque el anticuerpo recombinante pertenece al siguiente grupo: Fab, F(ab')2, scFv, y anticuerpos recombinantes monodominio (dAbs), preferentemente dAbs, y más preferentemente V_HH de camélidos.

15. Uso del microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en la elaboración de un medicamento o composición terapéutica útil para el tratamiento de enfermedades humanas, animales o de plantas.

16. Medicamento o composición terapéutica útil para el tratamiento de enfermedades humanas, animales o de plantas que comprende el microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

17. Medicamento o composición terapéutica según la reivindicación 16 para el tratamiento de la angiogénesis tumoral, el cáncer, un proceso inflamatorio, inmunodepresión y transplantes e infecciones virales, bacterianas y fúngicas.