Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas y en cultivos iniciadores para leches fermentadas.

El procedimiento permite la rápida y simultánea detección e identificación de diferentes especies de bacterias lácticas (S. thermophilus, L. bulgaricus, L. casei, L. acidophilus) en cultivos mixtos con B. lactis, especies habitualmente presentes en yogur y leches fermentadas que contienen probióticos. El procedimiento emplea cebadores de ADN específicas diseñados a partir del gen 165 rRNA para las bacterias lácticas y del gen de la transaldolasa para bifidobacterias. El procedimiento de identificación mediante amplificación específica por PCR se complementa con la separación de los productos amplificados mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con gradiente desnaturalizante (DGGE). La ventaja del método radica en que es capaz de realizar en una sola reacción la identificación conjunta de los cultivos mixtos presentes en leches fermentadas

Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas y en cultivos iniciadores para leches fermentadas.

Sector de la técnica

La técnica se encuadra dentro del Área Agroalimentaria, en el Sector Lácteo, y desarrolla un procedimiento para la detección e identificación de diferentes especies de bacterias lácticas y bifidobacterias específicas de poblaciones mixtas en yogures y leches fermentadas.

Estado de la técnica

Dentro del sector lácteo, el consumo de productos lácteos probióticos se encuentra en franca expansión, creciendo durante los últimos años no sólo en ventas sino también en la variedad de productos que se ofertan. Este hecho ha conducido a que desde enero de 2004 se incluyan en las estadísticas del Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación los datos sobre consumo de "yogur con bífidus" y "otras leches fermentadas". El registro del volumen de consumo en España de yogures y leches fermentadas comparativo entre mayo de 2004 y mayo de 2005 indica un incremento medio del consumo de productos probióticos en un 18%, los cuales representan casi un 10% del total consumido de yogures y productos relacionados [http://www.fenil.org/Documentos/Sector/Consumo/CompAcumUltimoAno/consumo_comparativa_mayo05-04.pdf].

La detección y correcta identificación de los microorganismos empleados como probióticos comercialmente es de gran importancia para garantizar la autenticidad de su etiquetado y, en su caso, para apoyar las posibles alegaciones de salud de estos alimentos. Los estudios de productos probióticos presentes en el mercado han reflejado, en general, una falta de precisión en la identificación/taxonomía de los microorganismos probióticos empleados tanto en diferentes productos lácteos como en concentrados liofilizados y en preparados farmacéuticos/nutracéuticos [Fasoli, S., Marzotto, M., Rizzotti, L., Rossi, F., Dellaglio, F., Torriani, S. (2003) Int. J. Food Microbiol. 82:59-70; Temmerman, R., Pot, B., Huys, G., Swings, J. (2003) Int. J. Food Microbiol. 81:1-10]. Estudios recientes realizados sobre la diversidad de especies de lactobacilos y bifidobacterias presentes en leches fermentadas comercializadas en España indican una creciente mejora en la equivalencia entre las especies etiquetadas y las presentes en el producto detectadas por técnicas moleculares [Gueimonde, M., Delgado, S., Mayo, B., Ruas-Madiedo, P., Margolies, A., de los Reyes-Gavilán, C. G. (2004) Food Res. Int. 37:839-850]. Aún así, ninguna de las muestras analizadas en el estudio contenía más de una especie de lactobacilos probióticos y en la mayoría de leches fermentadas ni siquiera a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. La dificultad de estos estudios, por tanto, aumenta cuando concurren un mayor número de especies en el mismo producto.

La identificación tradicional de microorganismos basada en características fenotípicas es bastante lenta y no siempre adecuada para la correcta identificación o diferenciación entre especies muy próximas taxonómicamente. El reemplazo lógico sucedido en este aspecto ha sido el empleo de técnicas moleculares para complementar o sustentar la identificación de especies bacterianas. La mayoría de estas técnicas se han basado en el análisis de secuencias específicas presentes en genes integrantes del operón del ARN ribosómico y en las regiones intergénicas espaciadoras [Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. (1995) Microbiol. Rev. 59:143-169]. Este hecho se basa en el carácter universal del funcionamiento de estos genes que conduce a la presencia de regiones conservadas, amplificadas por cebadores universales, y de regiones variables que permiten establecer agrupaciones filogenéticas según el grado de homología de las secuencias nucleotídicas y, por tanto, la identificación de especies bacterianas. Sin embargo, la comparación de secuencias del gen 16S rRNA de bifidobacterias refleja una elevada analogía entre las especies (similitud que oscila entre 92 y 99%) que dificulta su diferenciación basada en el análisis de dicha secuencia, por lo que se han buscado otros genes polimórficos para la identificación de estas especies, como es el que codifica para la enzima transaldolasa [Requena, T., Burton, J., Matsuki, T., Munro, K., Simon, M.A., Tanaka, R., Tannock, G.W. (2002) Appl. Environ. Microbiol. 68:2420-2427].

La combinación de técnicas específicas para la detección e identificación bacteriana basada en técnicas moleculares como amplificación por PCR y separación de los fragmentos mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con gradiente desnaturalizante (DGGE), constituye una herramienta de gran utilidad para el estudio de poblaciones microbiológicas complejas en ecosistemas naturales sin necesidad de realizar una separación previa de los diferentes componentes en la mezcla. El empleo de PCR-DGGE se ha aplicado a numerosas y complejas comunidades microbiológicas [Muyzer, G., Smalla, K. (1998) Antonie Van Leeuwenhoek 73:127-141; Zoetendal, E. G., Collier, C. T., Koike, S., Mackie, R. I., Gaskins, H. R. (2004) J. Nutr. 134:465-472], mientras que se ha incorporado sólo recientemente en el estudio de comunidades microbiológicas presentes en alimentos fermentados [Ercolini, D. (2004) J. Microbiol. Meth. 56:297-314] y más concretamente en quesos [Randazzo, C.L., Torriani, S., Akkermans, A.D.L., de Vos, W.M., Vaughan, E.E. (2002) Appl. Environ. Microbiol. 68:1882-1892].

El objeto de la presente invención consiste en la aplicación de un procedimiento de detección e identificación rápida y específica de diferentes especies de bacterias lácticas y bifidobacterias presentes en poblaciones mixtas en leches fermentadas y en cultivos iniciadores para leches fermentadas, basado en el diseño de cebadores inéditos y específicos de especie para la amplificación por PCR de secuencias identificadas en regiones variables del 16S rRNA de S. thermophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus y L. casei subsp. casei y del gen de la transaldolasa en B. lactis y se complementa con la diferenciación de los fragmentos obtenidos mediante separación por DGGE. Las especies objeto del estudio son añadidas habitualmente como cultivos iniciadores en leches fermentadas probióticas comercializadas en España. Las ventajas del procedimiento son la rapidez y el análisis específico y simultaneo de todas las especies presentes en una misma muestra en estudio.

En relación a las patentes internacionales existentes relacionadas con el tema objeto de la presente invención, se destacan: (i) la patente W09709448 publicada en 1997, solicitada por los inventores Alatossava, T. y Tilsala-Timisjaervi, A. (Finlandia), que se caracteriza por emplear la secuencia de la región espaciadora entre los genes 16S y 23S rRNA para la identificación específica de lactobacilos y S. thermophilus; (ii) las patentes JP11151097 y JP11123093, publicadas en 1999 y solicitadas por la empresa Yakult Honska KK, que se caracterizan por la descripción de oligonucleótidos utilizables para la identificación genérica de bacterias lácticas y bifidobacterias, respectivamente; y (iii) la patente W02005103294 publicada en 2005, solicitada por los inventores Park, Y.-H., Bae, J.-W., Rhee, S.-K., Park, J. R., Kim, B.-C. (Corea) que se caracteriza por emplear la tecnología de "microarrays" para la detección e identificación de bacterias lácticas, bifidobacterias y propionibacterias. No obstante, no existe ningún procedimiento patentado para la detección e identificación de bacterias lácticas y bifidobacterias en cultivos mixtos en leches fermentadas empleando la tecnología PCR-DGGE.

Descripción de la invención

Se ha desarrollado un procedimiento que permite la rápida detección e identificación de diferentes especies de bacterias lácticas (S. thermophilus, L. bulgaricus, L. casei, L. acidophilus) en cultivos mixtos con B. lactis, especies habitualmente presentes en yogur y leches fermentadas que contienen probióticos. El procedimiento emplea secuencias de ADN específicas (cebadores) diseñadas a partir del gen 16S rRNA para las especies de bacterias lácticas y del gen de la transaldolasa para bifidobacterias y que se utilizan para la identificación del ADN procedente de las mencionadas especies mediante amplificación específica por PCR. El procedimiento de identificación se complementa con la separación de los productos amplificados mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con gradiente desnaturalizante (DGGE).

1. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas caracterizado por el uso de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa mediante una única reacción con cebadores que comprenden oligonucleótidos específicos de regiones variables del gen 16S rRNA para las bacterias lácticas y del gen de la transaldolasa para bifidobacterias.

2. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según la reivindicación 1, caracterizado porque se realiza la detección e identificación de diferentes especies de bacterias lácticas (S. thermophilus, L. bulgaricus, L. casei, L. acidophilus) en cultivos mixtos con B. lactis, especies habitualmente presentes en yogur y leches fermentadas que contienen probióticos en mezcla de las cinco especies o en las diferentes combinaciones binarias, ternarias o cuaternarias obtenidas a partir de las cinco especies.

3. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque los cebadores seleccionados para las bacterias lácticas se derivan de la secuencia nucleotídica presente entre las regiones variables V1 y V2 del gen 16S rRNA y los cebadores seleccionados para B. lactis se derivan de regiones variables presentes en la secuencia nucleotídica del gen de la transaldolasa.

4. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por utilizar la pareja de oligonucleótidos específicos de S. thermophilus, SEQ ID N01 y SEQ ID N02 que generan un producto de PCR de 157 pb.

5. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por utilizar la pareja de oligonucleótidos específicos de L. bulgaricus, SEQ ID N03 y SEQ ID N04 que generan un producto de PCR de 232 pb.

6. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por utilizar la pareja de oligonucleótidos específicos de L. acidophilus, SEQ ID N05 y SEQ ID N06 que generan un producto de PCR de 227 pb.

7. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por utilizar la pareja de oligonucleótidos específicos de L. casei, SEQ ID N07 y SEQ ID N08 que generan un producto de PCR de 142 pb.

8. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por utilizar la pareja de oligonucleótidos específicos de B. lactis, SEQ ID N09 y SEQ ID N010 que generan un producto de PCR de 116 pb.

9. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la identificación mediante amplificación específica por PCR se complementa con la separación de los productos amplificados mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con gradiente desnaturalizante (DGGE) para lo que en la reacción de PCR se añade a uno de los cebadores la abrazadera GC, es decir, una extensión de nucleótidos en posición 5' constituida por la secuencia SEQ ID N011.

10. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según la reivindicación 9, caracterizado porque la identificación de S. thermophilus, se hace añadiendo a SEQ ID N01 una extensión de nucleótidos en posición 5' constituida por la secuencia SEQ ID N011.

11. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según la reivindicación 9, caracterizado porque la identificación de L. bulgaricus, se hace añadiendo a SEQ ID N04 una extensión de nucleótidos en posición 5' constituida por la secuencia SEQ ID N011.

12. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según la reivindicación 9, caracterizado porque la identificación de L. acidophilus, se hace añadiendo a SEQ ID N05 una extensión de nucleótidos en posición 5' constituida por la secuencia SEQ ID N011.

13. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según la reivindicación 9, caracterizado porque la identificación de L. casei, se hace añadiendo a SEQ ID N07 una extensión de nucleótidos en posición 5' constituida por la secuencia SEQ ID N011.

14. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según la reivindicación 9, caracterizado porque la identificación de B. lacti, se hace añadiendo a SEQ ID N010 una extensión de nucleótidos en posición 5' constituida por la secuencia SEQ ID N011.

15. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la amplificación de los fragmentos de doble cadena se realiza con las parejas de oligonucleótidos cebadores indicados en las reivindicaciones 1 a 8 correspondientes a las cinco especies, a partir de una suspensión de las colonias, calentada a 100ºC y congelada a -20ºC y bajo las siguientes condiciones preferentes:

16. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la amplificación de los fragmentos de doble cadena se realiza con las parejas de oligonucleótidos cebadores indicados en las reivindicaciones 1 a 8 correspondientes a las cinco especies, a partir de ADN total y bajo las siguientes condiciones preferentes:

17. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque la amplificación de los fragmentos de doble cadena se realiza con las parejas de oligonucleótidos cebadores indicados en las reivindicaciones 9 a 14 correspondientes a las cinco especies, a partir de ADN total y bajo las siguientes condiciones preferentes:

18. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según las reivindicaciones 15 y 16, caracterizado porque utiliza como material de partida colonias y cultivos de las especies bacterianas, respectivamente.

19. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según la reivindicación 17, caracterizado porque utiliza como material de partida leches fermentadas, yogures, derivados lácteos o alimentos que los contengan o los utilicen como ingredientes.

20. Pareja de oligonucleótidos cebadores específicos de S. thermophilus, SEQ ID N01 y SEQ ID N02 que generan un producto de PCR de 157 pb que permite la detección e identificación simultánea de esta bacteria láctica en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas por PCR según las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 15 y 16.

21. Pareja de oligonucleótidos cebadores específicos de L. bulgaricus, SEQ ID N03 y SEQ ID N04 que generan un producto de PCR de 232 pb que permite la detección e identificación simultánea de esta bacteria láctica en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas por PCR según las reivindicaciones 1, 2, 3, 5, 15 y 16.

22. Pareja de oligonucleótidos cebadores específicos de L. acidophilus, SEQ ID N05 y SEQ ID N06 que generan un producto de PCR de 227 pb que permite la detección e identificación simultánea de esta bacteria láctica en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas por PCR según las reivindicaciones 1, 2, 3, 6, 15 y 16.

23. Pareja de oligonucleótidos cebadores específicos de L. casei, SEQ ID N07 y SEQ ID N08 que generan un producto de PCR de 142 pb que permite la detección e identificación simultánea de esta bacteria láctica en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas por PCR según las reivindicaciones 1, 2, 3, 7, 15 y 16.

24. Pareja de oligonucleótidos cebadores específicos de B. lactis, SEQ ID N09 y SEQ ID N010 que generan un producto de PCR de 116 pb que permite la detección e identificación simultánea de esta bacteria en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas por PCR según las reivindicaciones 1, 2, 3, 8, 15 y 16.

25. Pareja de oligonucleótidos cebadores específicos de S. thermophilus, SEQ ID N01 con una extensión de nucleótidos en posición 5' constituida por la secuencia SEQ ID N011 y SEQ ID N02 que generan un producto de PCR de 197 pb que permite la detección e identificación simultánea de esta bacteria láctica en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas por PCR según las reivindicaciones 1, 2, 3, 9, 10 y 17.

26. Pareja de oligonucleótidos cebadores específicos de L. bulgaricus, SEQ ID N03 y SEQ ID N04 con una extensión de nucleótidos en posición 5' constituida por la secuencia SEQ ID N011 que generan un producto de PCR de 272 pb que permite la detección e identificación simultánea de esta bacteria láctica en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas por PCR según las reivindicaciones 1, 2, 3, 9, 11 y 17.

27. Pareja de oligonucleótidos cebadores específicos de L. acidophilus, SEQ ID N05 con una extensión de nucleótidos en posición 5' constituida por la secuencia SEQ ID N011 y SEQ ID N06 que generan un producto de PCR de 267 pb que permite la detección e identificación simultánea de esta bacteria láctica en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas por PCR según las reivindicaciones 1, 2, 3, 9, 12 y 17.

28. Pareja de oligonucleótidos cebadores específicos de L. casei, SEQ ID N07 con una extensión de nucleótidos en posición 5' constituida por la secuencia SEQ ID N011 y SEQ ID N08 que generan un producto de PCR de 182 pb que permite la detección e identificación simultánea de esta bacteria láctica en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas por PCR según las reivindicaciones 1, 2, 3, 9, 13 y 17

29. Pareja de oligonucleótidos cebadores específicos de B. lactis, SEQ ID N09 y SEQ ID N010 con una extensión de nucleótidos en posición 5' constituida por la secuencia SEQ ID N011 que generan un producto de PCR de 156 pb que permite la detección e identificación simultánea de esta bacteria en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas por PCR según las reivindicaciones 1, 2, 3, 9, 14 y 17.

30. Kit de diagnóstico por PCR para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas caracterizado por amplificar un fragmento del gen 16S rRNA para las bacterias lácticas y del gen de la transaldolasa para bifidobacterias según los procedimientos descritos en las reivindicaciones 1 a 17 y por emplear los cebadores descritos en las reivindicaciones 18 a 29.