Composición y procedimiento para extraer beta-lactoglobulina de muestras procesadas y no procesadas y método de inmunoensayo para beta-lactoglobulina.

Composición y procedimiento para extraer beta-lactoglobulina de muestras y un método de inmunoensayo para el análisis de beta-lactoglobulina ({be}-lactoglobulina, {be}-LG). Se refiere a una composición y un procedimiento para extraer la {be}-lactoglobulina ({be}-LG) existente en productos, que consiste en el empleo de una mezcla de un agente disruptor de puentes disulfuro y un agente desnaturalizante en un tampón de pH neutro o ligeramente básico, seguido por una etapa de tratamiento con una solución salina. Pueden ser empleados para extraer {be}-LG contenida en muestras de distintos orígenes sometidas o no a distintos procesos, como etapa previa a su análisis mediante inmunoensayo. Dicho método es válido para el análisis de productos, en particular para los destinados a personas alérgicas a {be}-LG. La invención se refiere tambiénal análisis de {be}-LG y en especial al análisis mediante inmunoensayo y más concretamente mediante un ensayo en inmunoadsorbentes con detección enzimática (ELISA)

Composición y procedimiento para extraer ß-lactoglobulina de muestras procesadas y no procesadas y método de inmunoensayo para ß-lactoglobulina.

Sector de la técnica

Esta invención se refiere, en general, al análisis del alergeno ß-lactoglobulina (ß-LG) en productos y especialmente a una composición y un procedimiento para extraer esta proteína de los productos, que es compatible con su análisis. La invención se refiere también al análisis de este alergeno mediante un inmunoensayo, y en especial mediante un ensayo en inmunoadsorbentes con detección enzimática (ELISA). La invención es de especial interés para los sectores alimentario, farmacéutico y clínico.

Estado de la técnica

La ß-lactoglobulina (ß-LG es una de las proteínas mayoritarias de la leche. Asimismo es uno de los principales alergenos existentes en alimentos, cuya ingestión puede causar serios trastornos, incluso la muerte, en personas, especialmente niños con alergia a esta proteína de la leche.

Su determinación en alimentos es por tanto importante a dos niveles. El primero en alimentos especialmente fabricados para el consumo de personas alérgicas a ß-LG. El segundo en alimentos formulados sin leche ni componentes lácteos, pero que pudieran resultar contaminados al realizarse su fabricación en las mismas líneas industriales que la de alimentos que contienen productos lácteos.

La producción de fármacos en animales transgénicos que da lugar a la excrección de los fármacos en la leche hace necesario controlar la ausencia de ß-LG en los mismos.

Existen métodos para la determinación de esta proteína en leche y productos lácteos. Sin embargo, para el análisis de ß-LG en otros productos como por ej. fármacos producidos en animales transgénicos o en matrices alimentarias con otros componentes de origen animal o vegetal, sometidos a distintos tratamientos, o bien su uso no ha sido descrito o su aplicación ha conducido a resultados inexactos e imprecisos.

Las proteínas de la leche pueden dividirse en dos grupos: las proteínas de suero lácteo, que son solubles a pH aproximado 4,6 y las caseínas, que son insolubles en estas condiciones. La ß-LG pertenece al primer grupo. La ß-LG, al ser una globulina, es soluble en soluciones salinas.

Los métodos existentes emplean generalmente como agente de extracción de ß-LG una solución salina.

El tratamiento de los productos lácteos, en especial el térmico, provoca la desnaturalización parcial de la ß-LG y su incorporación a las micelas de caseína.

El calentamiento de ß-LG en presencia de otros componentes, como por ejemplo componentes de alimentos de origen animal y vegetal, puede provocar la interacción del alergeno con esos componentes.

En productos en los que haya interacción de ß-LG con otros componentes no es posible realizar la extracción de esta proteína únicamente con soluciones salinas.

Por tanto, la determinación de ß-LG en productos sometidos a algún tipo de tratamiento, independientemente del método empleado para su análisis, no es exacta si la extracción se realiza únicamente empleando una solución salina.

Descripción de la invención

Desarrollo de una composición y un procedimiento para la extracción de ß-LG existente en productos con componentes de origen mineral, animal y/o vegetal sometidos a distintos tratamientos, que es compatible con el método ELISA puesto a punto para cuantificar esta proteína en alimentos.

La solución proporcionada por esta invención se basa en el conocimiento del empleo de un agente disruptor de puentes disulfuro para la liberación de ß-LG asociada a las micelas de caseína (M.M. Calvo, J. Leaver, A.J.R. Law, J.M. Banks, Milchwissenschaft 47 (1992) 343), en el conocimiento del empleo de una solución conteniendo un agente disruptor de puentes disulfuro y un agente desnaturalizante para extraer otras proteínas, concretamente gluten de alimentos tratados térmicamente (Patente E. López Villar, M. Gómez Llorente, E. Méndez Corman PCT/ES02/00208) y en el conocimiento de la solubilidad de globulinas en soluciones salinas.

El empleo conjunto de la composición y el procedimiento de extracción de ß-LG desarrollados y del método ELISA puesto a punto permiten detectar la presencia de este alergeno en muestras de alimentos con una exactitud y precisión mucho mayor que los métodos comerciales existentes.

Un objeto de esta invención es una composición y un proceso para extraer ß-LG de alimentos que son compatibles con ELISA, que consiste en extraer ß-LG con una solución que contiene un agente disruptor de puentes disulfuro y un agente desnaturalizante a un pH controlado por una solución tampón, seguida por una etapa con una solución salina.

Un objeto adicional de esta invención es un método para determinar mediante inmunoensayo la ß-LG presente en alimentos, que consiste en la extracción previa de la ß-LG presente en la muestra mediante el proceso anteriormente mencionado de extracción de ß-LG.

La invención proporciona una composición, llamada en adelante composición de la invención, que consiste en un agente disruptor de puentes disulfuro, un agente desnaturalizante, y una solución tampón.

El agente disruptor de puentes disulfuro es un compuesto capaz de reducir los puentes disulfuro, como por ejemplo, 2-mercaptoetanol (2-ME).

El agente desnaturalizante es un compuesto con capacidad para cambiar la estructura de las proteínas, permitiendo mayor accesibilidad de los anticuerpos a las zonas de reconocimiento de la ß-LG existente en matrices complejas, como por ejemplo cloruro de guanidinio.

La solución tampón debe mantener el pH de la composición de la invención próximo a 7, como por ejemplo un tampón borato.

La invención también proporciona un proceso para extraer ß-LG de una muestra, llamado en adelante el proceso de la invención, que consiste en extraer la ß-LG de la muestra con una solución salina en presencia de la composición de la invención.

La solución salina es una solución en la que son solubles las globulinas, como por ejemplo una solución de cloruro sódico.

En una aplicación específica de la composición de la invención el agente disruptor de puentes disulfuro es 2-ME 24 mM, el agente desnaturalizante es cloruro de guanidinio 25 mM, la solución tampón es borato 2,5 mM a pH 8,3 (en proporción 5%).

En una aplicación específica del proceso de la invención, la composición de la invención es la indicada en la cláusula anterior y la solución salina es cloruro sódico 0,15 M.

La composición de la invención y el proceso de la invención son útiles para extraer ß-LG de productos lácteos.

La composición de la invención y el proceso de la invención también permiten extraer ß-LG de alimentos que contienen otros ingredientes, además de productos lácteos, y que han sido sometidos a distintos tratamientos térmicos.

La composición de la invención y el proceso de la invención pueden permitir también extraer ß-LG de otros productos, como por ej. fármacos.

Más específicamente, el proceso de la invención, que consiste en extraer ß-LG con una solución salina y separar el sobrenadante que contiene la ß-LG extraída, se caracteriza porque antes de la extracción con esta solución salina la muestra a analizar se mezcla con la composición de la invención, incubándose a temperatura ambiente durante un tiempo de 2 horas.

La muestra de alimento a ser analizada se prepara triturándola, si es necesario, y mezclándola con una solución acuosa. A continuación se realiza una etapa de desnatado. Después se añade la composición de la invención. Transcurrido el periodo de extracción se aísla la ß-LG en la fracción soluble.

En una aplicación específica la solución acuosa con que se mezcla la muestra es una solución salina con fosfato (PBS).

En una aplicación específica la etapa de desnatado se realiza del siguiente modo: tras un periodo de agitación de la mezcla anterior de 10 min a temperatura ambiente, se calienta durante 20 min a una temperatura de 40ºC, se realiza una etapa de centrifugación a 2000 g durante 20 min a 25ºC, se sumerge en un baño de hielo durante 15 min y se elimina la grasa manualmente.

En una aplicación específica,...

1. Composición para extraer beta-lactoglobulina de muestras caracterizada por un agente disruptor de puentes disulfuro y un agente desnaturalizante en una solución tampón.

2. Composición para extraer beta-lactoglobulina de muestras de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizada porque el agente disruptor de puentes disulfuro es 2-mercaptoetanol.

3. Composición para extraer beta-lactoglobulina de muestras de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2 caracterizada porque en que la concentración de 2-mercaptoetanol es de 24 mM.

4. Composición para extraer beta-lactoglobulina de muestras de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3 caracterizada porque el agente desnaturalizante es cloruro de guanidinio.

5. Composición para extraer beta-lactoglobulina de muestras de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4 caracterizada porque la concentración de cloruro de guanidinio es 25 mM.

6. Composición para extraer beta-lactoglobulina de muestras de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5 caracterizada porque la solución tampón es una solución borato de pH 8,3.

7. Procedimiento para extraer beta-lactoglobulina de muestras caracterizada por la utilización de un agente disruptor de puentes disulfuro y un agente desnaturalizante en una solución tampón de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, previo al tratamiento con una solución salina.

8. Procedimiento para extraer beta-lactoglobulina de muestras de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada porque la solución salina es cloruro sódico.

9. Procedimiento para extraer beta-lactoglobulina de muestras de acuerdo con las reivindicaciones 7 y 8 en que la concentración de cloruro sódico es 0,15 M.

10. Procedimiento para extraer beta-lactoglobulina de muestras de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 caracterizada por mezclar la muestra a ser estudiada con una composición según las reivindicaciones 1 a 6, incubar la mezcla resultante, añadir una solución salina y separar el sobrenadante que contiene la ß-LG extraída.

11. Procedimiento para extraer beta-lactoglobulina de muestras de acuerdo con la reivindicación 10 en que la muestra es incubada con la composición a temperatura ambiente durante 2 horas.

12. Procedimiento para extraer beta-lactoglobulina de muestras de acuerdo con la reivindicación 10 y 11 en que la incubación con la solución salina es realizada a temperatura ambiente durante 1 hora.

13. Procedimiento para extraer beta-lactoglobulina de muestras de acuerdo con las reivindicaciones 10 a 12 en que la separación del sobrenadante es realizada por centrifugación seguida de filtración.

14. Método de inmunoensayo para el análisis de la ß-LG caracterizado por el empleo de un detergente y/o suero animal en un tampón como soluciones de lavado y pasivado y como diluyente de anticuerpos y muestras.

15. Método de inmunoensayo para el análisis de la ß-LG de acuerdo con la reivindicación 14 caracterizado porque el detergente es no fónico de tipo polioxietilensorbitano.

16. Método de inmunoensayo para el análisis de la ß-LG de acuerdo con las reivindicaciones 14 a 15 caracterizado porque el suero animal es suero de la misma especie animal en que se producen los anticuerpos empleados.

17. Método de inmunoensayo para el análisis de la ß-LG de acuerdo con las reivindicaciones 14 a 16 caracterizado porque el suero animal es suero de conejo.

18. Método de inmunoensayo para el análisis de la ß-LG de acuerdo con las reivindicaciones 14 a 17 caracterizado porque el tampón es PBS.

19. Uso del procedimiento, según reivindicaciones anteriores, para extracción y análisis de la beta-lactoglobulina existente en productos procesados o no procesados de cualquier origen de acuerdo con las reivindicaciones anteriores.

20. Uso del procedimiento, según la reivindicación 19, cuando los procedimientos proceden de los sectores alimentario, farmacéutico y clínico.

21. Uso del procedimiento según reivindicación 19 para garantizar la seguridad de las instalaciones que contienen productos lácteos y suministran alimentos a personas alérgicas a la ß-LG.