LA INVENCION TRATA DE ANIMALES NO HUMANOS TRANSGENICOS CAPACES DE PRODUCIR ANTICUERPOS HETEROLOGOS Y PROCEDIMIENTOS PARA PRODUCIR ANTICUERPOS DE SECUENCIA HUMANA QUE SE UNEN A ANTIGENOS HUMANOS CON AFINIDAD SUSTANCIAL

Animales transgénicos no humanos capaces de producir anticuerpos heterólogos.

Campo técnico

La invención se refiere a animales transgénicos no humanos capaces de producir anticuerpos heterólogos, a transgenes usados para producir dichos animales transgénicos, a transgenes capaces de reorganizar funcionalmente un gen D heterólogo en recombinación V-D-J, a células B inmortalizadas capaces de producir anticuerpos heterólogos, a métodos y transgenes para producir anticuerpos heterólogos de múltiples isotipos, a métodos y transgenes para producir anticuerpos heterólogos en los que una secuencia de región variable comprende una mutación somática en comparación con secuencias de región variable reorganizadas de la línea germinal, a animales transgénicos no humanos que producen anticuerpos que tienen una secuencia primaria humana y que se unen a antígenos humanos, a hibridomas generados a partir de células B de dichos animales transgénicos y a anticuerpos monoclonales expresados por dichos hibridomas.

Antecedentes de la invención

Uno de los impedimentos principales de cara al desarrollo de aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico in vivo para anticuerpos monoclonales en seres humanos es la inmunogenicidad intrínseca de inmunoglobulinas no humanas. Por ejemplo, cuando se administran dosis terapéuticas de anticuerpos monoclonales de roedor a pacientes humanos inmunocompetentes, los pacientes producen anticuerpos contra las secuencias de inmunoglobulina de roedor; estos anticuerpos anti-ratón humanos (HAMA) neutralizan los anticuerpos terapéuticos y pueden causar una toxicidad aguda. Por lo tanto, es deseable producir inmunoglobulinas humanas que sean reactivas con antígenos humanos específicos que sean dianas terapéuticas y/o de diagnóstico prometedoras. Sin embargo, la producción de inmunoglobulinas humanas que se unen específicamente con antígenos humanos es problemática.

La presente tecnología para generar anticuerpos monoclonales implica pre-exponer o sensibilizar a un animal (habitualmente una rata o ratón) con antígeno, recoger células B de ese animal y generar una biblioteca de clones de hibridoma. Mediante la exploración en una población de hibridoma de la especificidad de unión a antígeno (idiotipo) y también la exploración de clase de inmunoglobulina (isotipo), es posible seleccionar clones de hibridoma que secreten el anticuerpo deseado.

Sin embargo, cuando los presentes métodos para generar anticuerpos monoclonales se aplican con el fin de generar anticuerpos humanos que tengan especificidades de unión por antígenos humanos, la obtención de linfocitos B que produzcan inmunoglobulinas humanas es un obstáculo serio, puesto que típicamente los seres humanos no generarán respuestas inmunes contra antígenos propios.

Por lo tanto, los presentes métodos de generación de anticuerpos monoclonales humanos que son específicamente reactivos con antígenos humanos son claramente insuficientes. Es evidente que las mismas limitaciones en la generación de anticuerpos monoclonales contra autoantígenos auténticos son aplicables cuando se usan especies no humanas como fuente de células B para generar el hibridoma.

La construcción de animales transgénicos que alberguen un transgén de inmunoglobulina heterólogo funcional es un método por el que pueden producirse anticuerpos reactivos con autoantígenos. Sin embargo, para obtener la expresión de anticuerpos terapéuticamente útiles o clones de hibridoma que produzcan dichos anticuerpos, el animal transgénico debe producir células B transgénicas que sean capaces de madurar a través de la ruta de desarrollo de linfocitos B. Dicha maduración requiere la presencia de IgM de superficie en las células B transgénicas, sin embargo se desean isotipos distintos de IgM para usos terapéuticos. Por lo tanto, existe la necesidad de transgenes y animales que alberguen dichos transgenes que sean capaces de experimentar una reorganización V-D-J funcional para generar una diversidad de recombinación y una diversidad de unión. Además, dichos transgenes y animales transgénicos incluyen preferiblemente secuencias que actúan en cis que facilitan el cambio de isotipo de un primer isotipo que es necesario para la maduración de células B a un isotipo posterior que tiene una utilidad terapéutica superior.

Varios experimentos han notificado el uso de líneas celulares transfectadas para determinar las secuencias de ADN específicas necesarias para la reorganización de genes de Ig (revisado por Lewis y Gellert (1989), Cell, 59, 585-588). Dichos informes han identificado secuencias supuestas y concluido que la accesibilidad de estas secuencias a las enzimas recombinasas usadas para la reorganización está modulada por la transcripción (Yancopoulos y Alt (1985), Cell, 40, 271-281). Las secuencias para la unión de V(D)J son, según se informa, un heptámero casi palindrómico altamente conservado y un nanómero rico en AT peor conservado separados por un espaciador de 12 ó 23 pb (Tonegawa (1983), Nature, 302, 575-581; Hesse, et al. (1989), Genes in Dev., 3, 1053-1061). Según se informa, la recombinación eficaz se produce sólo entre sitios que contienen secuencias señal de recombinación con regiones espaciadoras de longitud diferente.

La reorganización de genes de Ig, aunque se ha estudiado en células de cultivo de tejidos, no se ha examinado exhaustivamente en ratones transgénicos. Sólo se han publicado un puñado de informes que describen construcciones de ensayo de reorganización introducidas en ratones [Buchini, et al. (1987), Nature, 326, 409-411 (transgén ? de pollo sin reorganizar); Goodhart, et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 4229-4233) (gen ? de conejo sin reorganizar); y Bruggemann, et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6709-6713 (cadena pesada humana-de ratón híbrida)]. Los resultados de dichos experimentos, sin embargo, han sido variables en algunos casos, produciendo una reorganización incompleta o mínima del transgén.

Además se ejerce una diversidad de funciones biológicas de moléculas de anticuerpo por la porción Fc de moléculas, tales como la interacción con mastocitos o basófilos por medio de Fcvarepsilon, y además es deseable la unión del complemento por Fcµ o Fc? para generar una diversidad funcional de anticuerpos de una especificidad dada por variación de isotipo.

Aunque se han generado animales transgénicos que incorporan transgenes que codifican una o más cadenas de un anticuerpo heterólogo, no ha habido informes de transgenes heterólogos que experimenten un cambio de isotipo con éxito. Los animales transgénicos que no pueden realizar un cambio de isotipo están limitados a producir anticuerpos heterólogos de un solo isotipo y, más específicamente, están limitados a producir un isotipo que es esencial para la maduración de células B, tal como IgM y posiblemente IgD, que pueden ser de una utilidad terapéutica limitada. Por lo tanto, existe la necesidad de transgenes de inmunoglobulina heterólogos y animales transgénicos que sean capaces de cambiar de un isotipo necesario para el desarrollo de células B a un isotipo que tenga una característica deseada para uso terapéutico.

Basándose en lo anterior, está claro que existe la necesidad de métodos para producir eficazmente anticuerpos heterólogos, por ejemplo anticuerpos codificados por secuencias genéticas de una primera especie que se producen en una segunda especie. Más particularmente, existe la necesidad en la técnica de transgenes de inmunoglobulina heterólogos y animales transgénicos que sean capaces de experimentar una reorganización de genes V-D-J funcional que incorpore toda o una porción de un segmento génico D que contribuya a la diversidad de recombinación. Además, existe la necesidad en la técnica de transgenes y animales transgénicos que puedan soportar la recombinación V-D-J y el cambio de isotipo de modo que (1) pueda producirse el desarrollo de células B funcionales y (2) puedan producirse anticuerpos heterólogos terapéuticamente útiles. También existe la necesidad de una fuente de células B que pueda usarse para generar hibridomas que produzcan anticuerpos monoclonales para uso terapéutico o de diagnóstico en la especie particular para la que se diseñan. Un transgén de inmunoglobulina heterólogo capaz de una recombinación V-D-J funcional y/o capaz de un cambio de isotipo podría satisfacer estas necesidades.

De acuerdo con el objeto anterior, se proporcionan animales transgénicos no humanos que son capaces de producir un anticuerpo heterólogo, tal como un anticuerpo humano.

 

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Reivindicaciones:

1. Inmunoglobulina de secuencia humana que se une a proteína CD4 humana que comprende un segmento VH4-34, un segmento JH5 y una región CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia polipeptídica VINWFDP.

2. Inmunoglobulina de secuencia humana de acuerdo con la reivindicación 1, en la cual dicha inmunoglobulina comprende una secuencia polipeptídica de cadena pesada sustancialmente idéntica a una secuencia polipeptídica codificada por:

a)

o

b)

3. Inmunoglobulina de la secuencia humana de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende además un segmento VkL19, un segmento Jk2 y una región CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia polipeptídica QQANSFPYT.

4. Inmunoglobulina de secuencia humana de acuerdo con la reivindicación 3, en la cual dicha inmunoglobulina comprende una secuencia polipeptídica de cadena ligera sustancialmente idéntica a una secuencia polipeptídica codificada por:

a)

o

b)

5. Inmunoglobulina de secuencia humana de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha inmunoglobulina comprende una secuencia polipeptídica de una cadena pesada idéntica a una secuencia polipeptídica codificada por:

a)

o

b)

y en la cual la inmunoglobulina de secuencia humana comprende además un segmento VkL19, un segmento Jk2 y una secuencia polipeptídica de cadena ligera idéntica a una secuencia polipeptídica codificada por:

a)

o

b)

6. Inmunoglobulina de la secuencia humana de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que tiene una constante de avidez (K_a) de al menos 2 x 10⁹ M^-1.

7. Inmunoglobulina de la secuencia humana de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que tiene una constante de avidez (K_a) de al menos 1 x 10¹⁰ M^-1.

8. Inmunoglobulina de la secuencia humana de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que tiene una constante de avidez (K_a) de al menos 1,1 x 10¹⁰ M^-1.

9. Gen artificial que codifica un polipéptido de una cadena pesada de la inmunoglobulina de secuencia humana de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2.

10. Vector de expresión que codifica un polipéptido de una cadena pesada de la inmunoglobulina de secuencia humana como se define de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2.

11. Vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 10 que codifica además un polipéptido de una cadena ligera de la inmunoglobulina de secuencia humana como se define de acuerdo con las reivindicaciones 3 ó 4.

12. Célula que comprende un gen artificial que codifica un polipéptido de una cadena pesada de la inmunoglobulina de secuencia humana como se define de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2 y un gen artificial que codifica un polipéptido de una cadena ligera de la inmunoglobulina de secuencia humana como se define de acuerdo con las reivindicaciones 3 ó 4.

13. Célula de acuerdo con la reivindicación 12, en la que los dos genes artificiales están en un solo vector.

14. Composición que comprende la inmunoglobulina de secuencia humana de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

15. Procedimiento para expresar un polipéptido de inmunoglobulina de secuencia humana de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5 que implica:

a) la inserción de un ácido nucleico sintético que codifica una región de una inmunoglobulina en un vector que codifica los segmentos o partes restantes de la cadena de inmunoglobulina y

b) la introducción de dicho vector en una célula.

16. Procedimiento para expresar un polipéptido de inmunoglobulina de secuencia humana que comprende:

a) introducir un gen artificial que codifica un polipéptido de una cadena pesada de la inmunoglobulina de secuencia humana de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2 y un gen artificial que codifica un polipéptido de una cadena ligera de inmunoglobulina de secuencia humana de acuerdo con las reivindicaciones 3 ó 4 en la misma célula; o

b) introducir un gen artificial que codifica un polipéptido de una cadena pesada de la inmunoglobulina de secuencia humana de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2 en una célula que se ha modificado por ingeniería genética para expresar el producto de un gen artificial que codifica un polipéptido de una cadena ligera de la inmunoglobulina de secuencia humana de acuerdo con las reivindicaciones 3 ó 4; o

c) introducir un gen artificial que codifica un polipéptido de una cadena ligera de la inmunoglobulina de secuencia humana de acuerdo con las reivindicaciones 3 ó 4 en una célula que se ha modificado por ingeniería genética para expresar el producto de un gen artificial que codifica un polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina de secuencia humana de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2.

17. Inmunoglobulina de secuencia humana de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8 para su uso como producto farmacéutico.

18. Inmunoglobulina de secuencia humana de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en la reducción de la actividad de células CD4.

19. Inmunoglobulina de secuencia humana de acuerdo con la reivindicaciones 1 a 8 para su uso en el tratamiento de la inmunosupresión.

20. Inmunoglobulina de secuencia humana de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en el tratamiento de reacciones autoinmunes.

21. Inmunoglobulina de secuencia humana de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en el tratamiento de respuestas inflamatorias.

22. Inmunoglobulina de secuencia humana de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en el tratamiento del rechazo de órganos trasplantados.

23. Inmunoglobulina de secuencia humana de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en el tratamiento para su uso en el tratamiento de la artritis reumatoide.

24. Inmunoglobulina de secuencia humana de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en el tratamiento de micosis fungoide.

25. Composición farmacéutica que comprende una inmunoglobulina de secuencia humana de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8.

26. Uso in vitro de una inmunoglobulina de secuencia humana de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8 para diagnóstico.

 

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