Estructura cristalina de ADN y su utilización para la identificación de fármacos.

La estructura cristalina que comprende un entrecruzamiento de tres cadenas de ADN está caracterizada porque: pertenece al grupo espacial P4(1)32 y tiene unas dimensiones de celda a=b=c=70,98 +- 0,7{amstrongs}; todos los nucleótidos que constituyen dichas cadenas de ADN se encuentran emparejados; y dicho entrecruzamiento de tres cadenas de ADN alberga, en una cavidad hidrofóbica, una molécula. La estructura cristalina de la invención es una diana adecuada para el diseño de fármacos anti-ADN con una elevada especificidad

Estructura cristalina de ADN y su utilización para la identificación de fármacos.

Esta invención se relaciona con el campo de la biomedicina en general y específicamente con la investigación farmacológica y la biología molecular. En particular, la presente invención se refiere a una estructura cristalina de ADN del tipo de entrecruzamiento de tres cadenas y a su utilización en un procedimiento para la identificación de una molécula candidata a fármaco.

Estado de la técnica anterior

Los entrecruzamientos helicoidales son importantes elementos estructurales en los ácidos nucleicos. En el ADN son intermedios de los acontecimientos de recombinación genética homóloga y en el ARN son importantes elementos estructurales.

Los entrecruzamientos de ADN son estructuras ramificadas únicas que consisten en varias hebras dobles o cadenas que convergen en un punto. El entrecruzamiento de ADN mejor caracterizado es el de cuatro cadenas, también conocido como unión Holliday (en inglés "Holliday junction"), un intermedio clave en la recombinación homóloga (cf. R. Holliday, "A mechanism for gene conversion in fungi", Genet. Res. 1964, vol. 5, pp. 282-304). Han sido resueltas las estructuras tridimensionales de entrecruzamientos de cuatro cadenas libres (cf. M. Ortiz-Lombardia et al., "Crystal structure of a DNA Holliday junction", Nat Struct Biol 1999, vol. 6, pp. 913-7) y la de diferentes complejos con proteínas (cf. T. Biswas et al., "A structural basis for allosteric control of DNA recombination by lambda integrase", Nature 2005, vol. 435, pp. 1059-66; S. M. Roe et al., "Crystal structure of an octameric RuvA-Holliday junction complex", Mol Cell 1998, vol. 2, 361-72; D. N. Gopaul et al., "Structure of the Holliday junction intermediate in Cre-loxP site-specific recombination" 1998, Embo J vol. 17, pp. 4175-87; M.).

Los entrecruzamientos de tres cadenas, a pesar de ser las estructuras ramificadas de ácido nucleico más simples y más abundantes, no están bien caracterizadas. Los entrecruzamientos de tres cadenas se producen tanto en ARN como en ADN. En ARN se encuentran implicadas en funciones biológicas cruciales tales como el empalme (en inglés "splicing") (cf. C. Guthrie et al., "Spliceosomal snRNAs", Annu Rev Genet 1988, vol. 22, pp. 387-419) y la traducción (cf. A. Nikulin et al., "Crystal structure of the S15-rRNA complex", Nat Struct Biol 2000, vol. 7, pp. 273-7; B. T. Wimberly et al., "Structure of the 30S ribosomal subunit", Nature 2000, vol. 407, pp. 327-39; N. Ban et al., "The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution", Science 2000, vol. 289, pp. 905-20). En ADN, los entrecruzamientos de tres cadenas se forman temporalmente durante la replicación del ADN (cf. M. R. Singleton et al., "Structural analysis of DNA replication fork reversal by RecG", Cell 2001, vol. 107, pp. 79-89). Estas son estructuras intermedias formadas por expansiones de tripletes repetidos (cf. P. E. Pearson et al., "Slipped-strand DNAs formed by long (CAG)*(CTG) repeats: slipped-out repeats and slip-out junctions", Nucleic Acids Res 2002, vol. 30, pp. 4534-47) debidas, en varios casos, a anomalías asociadas con varias enfermedades genéticas en humanos tales como la distrofia miotónica tipo 1 y la enfermedad de Huntington (cf. R. R. Sinden, "Neurodegenerative diseases. Origins of instability", Nature 2001, vol. 411, pp. 757-8).

Por otro lado, los ácidos nucleicos han sido, tradicionalmente, objeto de diferentes estudios relacionados con diversas enfermedades, especialmente en el campo del cáncer.

Los fármacos que interaccionan con el ADN (también conocidos como fármacos anti-ADN) pueden unirse de manera covalente, como es el caso de los derivados de cis-Pt (de uso común en tratamientos anticancer), o de manera no covalente. Se conocen dos tipos principales de fármacos que interaccionan de manera no covalente con el ADN, los agentes intercalantes de ADN y los agentes de unión a surco menor. En la actualidad, los agentes de unión a surco menor están siendo investigados como agentes antibacterianos o anticancer.

Por otro lado, los compuestos conocidos de manera colectiva como agentes intercalantes se pueden unir entre las bases de ADN, interrumpiendo la transcripción, replicación y/o las actividades de las topoisomerasas, induciendo la muerte de las células cancerígenas. Algunos de estos agentes intercalantes también se utilizan profusamente en clínica como fármacos anticancer.

A pesar de los muchos esfuerzos realizados para rediseñar la estructura química de los fármacos anti-ADN, estos resultan ser, en general, fármacos no específicos con amplios efectos citotóxicos.

Por tanto, existe la necesidad de nuevos agentes terapéuticos anti-ADN que sean altamente citotóxicos y específicos para el desarrollo de terapias alternativas a las ya existentes, así como procedimientos para la identificación de los mismos.

Explicación de la invención

Los inventores de la presente invención han caracterizado una nueva estructura cristalina de ADN del tipo entrecruzamiento de tres cadenas (en inglés "3-way junction" y de aquí en adelante también abreviada como "3WJ") que es capaz de complejarse con un fármaco.

Por lo tanto, en un primer aspecto la presente invención se refiere a una estructura cristalina que comprende un entrecruzamiento de tres cadenas de ADN, dicha estructura cristalina caracterizada porque: pertenece al grupo espacial P4(1)32 y tiene unas dimensiones de celda a=b=c=70,98 pm 0,7Å;

todos los nucleótidos que constituyen dichas cadenas de ADN se encuentran emparejados; y dicho entrecruzamiento de tres cadenas de ADN alberga, en una cavidad hidrofóbica, una molécula.

La estructura cristalina de la 3WJ de ADN de la presente invención tiene una conformación no apilada (forma de Y) y tiene una cavidad hidrofóbica trigonal central en la que la molécula o sustancia utilizada como candidato a fármaco -helicato supramolecular [Fe₂L₃]Cl₄- encaja perfectamente, utilizando 9 de sus 12 anillos aromáticos para interaccionar con el ADN. Los inventores de la presente invención han utilizado una molécula de helicato bien conocida para el experto en la materia (cf. M. J. Hannon et al., "An inexpensive approach to supramolecular architecture", Chemical Communications 1997, pp. 1807-8) (Fig. 1a), para demostrar que la 3WJ de ADN es una estructura adecuada para que interaccionen fármacos.

De esta manera, la estructura cristalina de acuerdo con el primer aspecto de la invención puede ser útil como diana estructuralmente bien definida para la búsqueda e identificación de nuevos fármacos citotóxicos altamente específicos.

Tal y como se ilustra en el ejemplo adjunto, con la estructura cristalina del primer aspecto de la invención se consigue llevar a cabo una nueva aproximación para el reconocimiento del ADN y para el diseño de agentes que posean superficies moleculares complementarias a la 3WJ de ADN.

Los procedimientos generales de obtención de estructuras cristalinas que comprenden oligonucleótidos de ADN complejados o sin complejar con moléculas son bien conocidos por los expertos en la materia (cf. I. Berger et al. "A highly efficient 24-condition matrix for the crystallization of nucleic acid fragments", Acta Cryst. D 1996, D52(3), pp. 465-8).

Uno de los posibles procedimientos para obtener dichas estructuras es el que se describe en el ejemplo adjunto.

La estructura del entrecruzamiento en el complejo con el helicato metalo-supramolecular [Fe₂L₃]⁴⁺ (de geometría antiprisma trigonal) corresponde a un entrecruzamiento con forma de Y, no apilada, abierta. La estructura tiene simetría triple lo cual, en este caso, corresponde a una simetría cristalográfica favorecida por la naturaleza palindrómica de la secuencia oligonucleotídica utilizada (Figs. 1b y 2). Los tres brazos de la estructura son, por lo tanto, idénticos y no existe apilamiento coaxial hélice-a-hélice entre ellos. En cambio, el ángulo entre los brazos es de 110º, manteniéndose en una disposición piramidal casi plana (Fig. 2).

La estructura de la presente invención difiere de otras conocidas en el estado de la técnica, analizadas...

1. Estructura cristalina que comprende un entrecruzamiento de tres cadenas de ADN, dicha estructura cristalina caracterizada porque:

a) pertenece al grupo espacial P4(1)32 y tiene unas dimensiones de celda a=b=c=70,98 pm 0,7Å;

b) dichas cadenas de ADN son hexanucleótidos cuyas secuencias nucleotídicas, iguales o diferentes entre sí, se seleccionan del grupo que consiste en CGATCG, GCATGC, CGTACG, GCTAGC, CCATGG, GGATCC, CCTAGG y GGTACC, en los que todos los nucleótidos se encuentran emparejados; y

c) el entrecruzamiento de las tres cadenas de ADN alberga, en una cavidad hidrofóbica, una molécula.

2. Estructura cristalina según la reivindicación 1 caracterizada porque las tres cadenas de ADN tienen la misma secuencia nucleotídica y ésta es CGTACG.

3. Estructura cristalina según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada porque tiene las coordenadas atómicas dimensionales de la Tabla 1.

4. Estructura cristalina según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada por el hecho de que la molécula es un candidato a fármaco anti-ADN.

5. Procedimiento de identificación de una sustancia candidata a fármaco caracterizado porque comprende las etapas de:

a) obtener una estructura cristalina dejando crecer, a temperatura ambiente, gotas posadas que comprenden la sustancia a ser identificada y las secuencias nucleotídicas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2; y

b) determinar los parámetros de la estructura cristalina obtenida de manera que si dicha estructura pertenece al grupo espacial P4(1)32, tiene unas dimensiones de celda a=b=c=70,98 pm 0,7Å y todos los nucleótidos de las secuencias nucleotídicas de ADN se encuentran emparejados, es indicativo de que dicha sustancia es un candidato a fármaco anti-ADN.