Procedimiento para la identificación de las especies comerciales de la Familia Merlucciidae,

elementos necesarios y aplicaciones.La invención proporciona un procedimiento mediante espectrometría de masas para la identificación de las principales especies comerciales de la Familia Merlucciidae, en toda la cadena alimentaria. El objeto de la invención es el reconocimiento de las merluzas comerciales pertenecientes al género Merluccius: M. merluccius, M. capensis o M. senegalensis, M. polli, M. paradoxus, M. australis (incluyendo dos subespecies diferentes, M. australis australis y M. australis polylepsis), M. productus, M. bilinearis, M. hubbsi o M. gayi; o al género Macruronus, conocidas también como merluzas de cola: Macruronus novaelandiae con sus dos subespecies (Ma. nov. nov. y Ma. nov. magellanicus). Este procedimiento permite la identificación inequívoca de la especie concreta en menos de dos horas en todo tipo de productos y subproductos frescos, refrigerados, congelados y/o procesados, y/o precocinados

Procedimiento para la identificación de las especies comerciales de la Familia Merlucciidae, elementos necesarios y aplicaciones.

Sector de la técnica

La presente invención tiene aplicación en el sector de tecnología de productos pesqueros y gestión de pesquerías: control e inspección de la calidad y origen de materias primas; control y cumplimiento del etiquetado correcto de productos y subproductos; control del fraude al consumidor o al importador; conflictos pesqueros en aguas internacionales. Además, los productos de la invención podrían ser utilizados para el desarrollo de nuevas técnicas de detección de especies.

Estado de la técnica

La Familia Merlucciidae comprende dieciocho especies marinas englobadas dentro de cuatro géneros distintos (Merluccius, Macruronus, Lyconus y Lyconodes). Sólo los dos primeros son de gran interés pesquero a nivel mundial con un total de captura superior a los 1,8 millones de toneladas en el año 2004 (FIGIS FAO). En la Figura 1 se presenta el volumen de capturas según la especie. En toda Europa y sobre todo en España, la merluza es la especie más solicitada y apreciada por los consumidores.

Para atender a esta demanda el caladero europeo se ha sobreexplotado y las empresas transformadoras de pescado han empezado a importar y comercializar otras especies de la misma familia como sustitutos. Como el valor comercial varía según las especies y los productos derivados, las entidades administrativas deben proteger a los consumidores de sustitutos de especies de mayor valor, mediante medidas de control que aseguren un adecuado etiquetado del producto.

El control de origen y autenticidad de especies se hace más necesario cuanto mayor es la diversidad de especies susceptibles de ser comercializadas bajo el mismo nombre (la denominación genérica de "merluza" comprende trece especies distintas). Respecto a la captura, cuanto mayor es el grado de solapamiento geográfico entre los caladeros de la distintas especies, mayor es la frecuencia con la que se pueden pescar dos especies distintas y difícilmente distinguibles en una misma área (por ejemplo en Sudáfrica coexisten dos especies de merluza del Cabo -M. capensis y M. paradoxus- que son habitualmente pescadas en una misma pesquería). Y por último, cuanto mayor es el grado de procesado o manipulación del pescado previo a la venta (procesos de fileteado, eviscerado, descabezado, etc.), mayor es la dificultad de la identificación de los especímenes utilizados en dicho producto. A estas circunstancias hay que añadir la creciente exigencia del consumidor por estar adecuadamente informado de la composición de los alimentos en un mercado cada vez más global y, por tanto, más expuesto a riesgos sanitarios imprevisibles. En conclusión, existe una necesidad de obtener una información contrastada y veraz sobre la naturaleza y el origen de los alimentos.

Observando la legislación de ámbito internacional en materia de etiquetado el Codex Alimentarius o Código Alimentario (CODEX STAN 1-1985, Rev. 1-1991; FAO, OMS) ofrece normas y buenas prácticas. En la Unión Europea y los Estados miembros, el artículo 4, punto 2, del Reglamento (CE) nº 104/2000, del Consejo, de 17 de diciembre de 1999, que establece la Organización Común de Mercados en el sector de los productos de la pesca y de la acuicultura y dispone que "los Estados miembros establecerán y publicarán el listado de denominaciones comerciales de especies pesqueras y de acuicultura". En nuestro país el Real Decreto 1380/2002, de 20 de Diciembre y el Real Decreto 121/2004, de 23 de Enero -teniendo en cuenta la Ley 3/2001, de 26 de Marzo de Pesca Marítima del Estado sobre comercialización de productos pesqueros- regulan respectivamente, la identificación y el etiquetado de los productos de la pesca, la acuicultura y el marisqueo, congelados o ultracongelados el primero, y vivos, frescos, refrigerados o cocidos el segundo. Un requisito fundamental del etiquetado de productos pesqueros es la indicación clara del nombre de la especie utilizada. En la Tabla 1 figuran las denominaciones comerciales para los miembros de la Familia Merlucciidae según la legislación vigente en España.

La existencia de una legislación en materia de denominación comercial necesita herramientas fiables que permitan la identificación certera del origen y naturaleza del producto. Estas herramientas deben basarse en metodologías analíticas que identifiquen la especie de partida en un producto elaborado donde ya no existan indicios morfológicos o sensoriales. El primer intento de caracterización sin atender a rasgos evidentes fue realizado por Jones y Mackie en 1970, a partir de perfiles electroforéticos de proteínas del músculo. Más tarde, los mismos autores establecieron una serie de perfiles electroforéticos específicos a partir de las proteínas de la fracción sarcoplásmica de cinco especies de merluza: M. merluccius, M. australis, M. productus, M. bilinearis y M. angustimanus (Mackie y Jones, 1978). Otros ensayos basados en técnicas electroforéticas se presentan en Grant y col., 1987; Roldan y col., 1998; Piñeiro y col., 2000; Tepedino y col., 2001. La electroforesis bidimensional (2-DE) constituye una herramienta rápida y sencilla para la caracterización e identificación de especies de pescado; se han hallado patrones específicos para las distintas especies de merluza (Piñeiro y col., 1998; Piñeiro y col., 2001; Carrera y col., 2006).

Sin embargo, en productos sometidos a procedimientos térmicos como los precocinados, resulta muy difícil reproducir los patrones electroforéticos, debido a la rápida degradación de las proteínas. Para obviar este problema se ha recurrido a las técnicas de Biología Molecular, gracias a su gran sensibilidad y a la naturaleza termoestable del ADN. Quinteiro y col. (2001) desarrollaron la técnica de PCR-RFLPs para identificar once especies del género Merluccius a partir de la amplificación por PCR de una región del ADN mitocondrial. Castillo y col. (2003) desarrollaron una metodología basada en la amplificación de ciertas regiones de los microsatélites para identificar tres especies del mismo género. Pérez y col. (2004) desarrollaron una estrategia basada en la amplificación de un gen de la subunidad 5S del ARN ribosómico para identificar nueve especies del género Merluccius. Pérez y col. (2005) desarrollaron una metodología genética basada en la amplificación por PCR de fragmentos de ITS1-rDNA para la identificación del género y de doce especies de Merluccius y que ha sido patentada (OEPM nº ES 2 237 271 y nº ES 2 237 285).

Las técnicas de Biología Molecular no se han aplicado a las merluzas de cola, de gran interés comercial. Además, resultan muy laboriosas y requieren mucho tiempo (18 horas a 2 días). Por tanto, existe la necesidad de un método alternativo y/o complementario a las técnicas existentes que permita: 1) la identificación de la amplia variedad de especies pertenecientes a la familia Merlucciidae; 2) la identificación en cualquier punto de la cadena alimentaria y en cualquier producto; 3) y una operación fácil y rápida.

Descripción de la invención

La invención presenta un procedimiento para la identificación rápida e inequívoca de las principales especies comerciales de la Familia Merlucciidae en cualquier punto de la cadena alimentaria y en cualquier producto fresco, refrigerado, congelado y/o procesado, y/o precocinado. La invención se basa en la monitorización mediante espectrometría de masas de una serie de péptidos específicos resultantes de la digestión de parvalbúminas.

Como novedad la invención constituye la herramienta más sencilla, sensible y rápida que permite obtener resultados de identificación en menos de 2 horas.

El procedimiento de la invención se fundamenta en que los inventores han descubierto que es posible la monitorización o determinación mediante espectrometría de masas de una serie de péptidos específicos para las distintas especies de merluza, resultantes de la tripsinización...

1. Procedimiento para la identificación de organismos pertenecientes a la Familia Merlucciidae que comprende:

a) extraer las proteínas sarcoplásmicas del músculo blanco de una muestra de un producto,

b) purificar las proteínas sarcoplásmicas termoestables (parvalbúminas) obtenidas en la etapa (a),

c) digerir las parvalbúminas de la etapa (b) con tripsina de cualquier origen,

d) determinar la presencia o ausencia de los péptidos G-MER517 (SEQ ID NO1), G-MAC524 (SEQ ID NO2), S-MER967 (SEQ ID NO3), S-MER794 (SEQ ID NO4), S-MER612 (SEQ ID NO5), S-MER736 (SEQ ID NO6), S-MER721 (SEQ ID NO7), S-MER590 (SEQ ID NO8), S-MER597 (SEQ ID NO9), S-MER973 (SEQ ID NO10) y S-MER987 (SEQ ID NO11), y

e) determinar la presencia o ausencia del organismo perteneciente a la Familia Merlucciidae mediante los datos obtenidos en la etapa (d) y, en el caso de determinar su presencia, proceder a su identificación.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, donde la presencia de G-MER517 (SEQ ID NO1) en la muestra indica la presencia de un organismo del género Merluccius spp.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, donde la presencia de G-MAC524 (SEQ ID NO2) indica la presencia de un organismo de la especie Macruronus novaezelandiae.

4. Procedimiento según la reivindicación 2, donde la presencia de S-MER967 (SEQ ID NO3) en la muestra indica la presencia de al menos una especie de merluza americana M. hubbsi, M. gayi, M. australis, M. productus o M. bilinearis.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, donde además la presencia de S-MER794 (SEQ ID NO4) en la muestra indica la presencia de la especie M. bilinearis.

6. Procedimiento según la reivindicación 4, donde además la presencia de S-MER612 (SEQ ID NO5) en la muestra indica la presencia de la especie M. productus.

7. Procedimiento según la reivindicación 4, donde además la presencia de S-MER736 (SEQ ID NO6) y la ausencia de S-MER271 (SEQ ID NO7) en la muestra indica la presencia de la especie M. australis polylepsis.

8. Procedimiento según la reivindicación 4, donde además la presencia de S-MER736 (SEQ ID NO6) y S-MER721 (SEQ ID NO7) en la muestra indica la presencia de la especie M. australis australis.

9. Procedimiento según la reivindicación 4, donde además la presencia en la muestra de S-MER590 (SEQ ID NO8) y la ausencia de los péptidos S-MER794 (SEQ ID NO4), S-MER612 (SEQ ID NO5), S-MER736 (SEQ ID NO6) y S-MER721 (SEQ ID NO7) indica la presencia de la especie M. hubbsi o M. gayi.

10. Procedimiento según la reivindicación 2, donde la ausencia de S-MER967 (SEQ ID NO3) en la muestra indica la presencia de al menos una especie de merluza euro-africana M. merluccius, M. capensis, M. senegalensis, M. polli o M. paradoxus.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, donde además la presencia de S-MER590 (SEQ ID NO8) y S-MER597 (SEQ ID NO9) en la muestra indica la presencia de la especie M. merluccius.

12. Procedimiento según la reivindicación 10, donde además la presencia en la muestra de S-MER597 (SEQ ID NO9) y la ausencia de S-MER590 (SEQ ID NO8) muestra indica la presencia de la especie M. capensis o M. senegalensis.

13. Procedimiento según la reivindicación 10, donde además la presencia de S-MER973 (SEQ ID NO10) en la muestra indica la presencia de la especie M. paradoxus.

14. Procedimiento según la reivindicación 10, donde además la presencia en la muestra de S-MER987 (SEQ ID NO11) y la ausencia de S-MER597 (SEQ ID NO9) indica la presencia de la especie M. polli.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde la etapa de purificación (b) se realiza calentando la muestra a 70ºC durante 5 min, y centrifugando posteriormente a 40.000 x g 10 min.

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde la etapa (c) de digestión se lleva a cabo mediante la aplicación de ultrasonidos de alta intensidad focalizados.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde la determinación de la presencia o ausencia de los péptidos según la etapa (d) se realiza mediante un espectrómetro de masas.

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde la determinación de la presencia o ausencia de los péptidos según la etapa (d) se realiza mediante cromatografía líquida de alta resolución acoplada a un espectrómetro de masas.

19. Procedimiento según la reivindicación 1 a 18, donde el espectrómetro de masas trabaja en cualquiera de los siguientes modos Data Dependent, SIM (selected ion monitoring), SIRM (selected ion reaction monitoring) y SRM (selected reaction monitoring).

20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, donde la muestra procede de un producto alimentario fresco o congelado.

21. Procedimiento según la reivindicación 20, donde el producto alimentario está procesado, precocinado o elaborado.

22. Péptido SEQ ID NO1 obtenido por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 y de la 15 a la 21.

23. Péptido SEQ ID NO2 obtenido por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 y de la 15 a la 21.

24. Péptido SEQ ID NO3 obtenido por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 y de la 15 a la 21.

25. Péptido SEQ ID NO4 obtenido por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 y de la 15 a la 21.

26. Péptido SEQ ID NO5 obtenido por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 y de la 15 a la 21.

27. Péptido SEQ ID NO6 obtenido por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 y de la 15 a la 21.

28. Péptido SEQ ID NO7 obtenido por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 y de la 15 a la 21.

29. Péptido SEQ ID NO8 obtenido por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 y de la 15 a la 21.

30. Péptido SEQ ID NO9 obtenido por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 y de la 15 a la 21.

31. Péptido SEQ ID NO10 obtenido por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 y de la 15 a la 21.

32. Péptido SEQ ID NO11 obtenido por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 y de la 15 a la 21.

33. Uso de al menos un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 32 para la generación de anticuerpos.

34. Anticuerpo específico de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 32.

35. Secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 32.

36. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y 20 ó 21, donde para determinar la presencia o ausencia de los péptidos según la etapa (d) se utiliza el anticuerpo según la reivindicación 34.

37. Procedimiento para la identificación de organismos pertenecientes a la Familia Merlucciidae que comprende:

a) extraer el ADN del músculo blanco de una muestra de producto,

b) determinar la presencia o ausencia de la secuencia de nucleótidos que codifica para los péptidos G-MER517 (SEQ ID NO1), G-MAC524 (SEQ ID NO2), S-MER967 (SEQ ID NO3), S-MER794 (SEQ ID NO4), S-MER612 (SEQ ID NO5), S-MER736 (SEQ ID NO6), S-MER721 (SEQ ID NO7), S-MER590 (SEQ ID NO8), S-MER597 (SEQ ID NO9), S-MER973 (SEQ ID NO10) y S-MER987 (SEQ ID NO11) en el ADN extraído en la etapa (a), y

c) determinar la presencia o ausencia del organismo perteneciente a la Familia Merlucciidae mediante los datos obtenidos en la etapa (b) y, en el caso de determinar su presencia, proceder a su identificación.

38. Procedimiento según la reivindicación 37, donde la determinación de la presencia o ausencia de la secuencia de nucleótidos según la etapa (b) se lleva a cabo por medio de amplificación de dicha secuencia por PCR.

39. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 37 ó 38, donde la muestra procede de un producto alimentario fresco o congelado.

40. Procedimiento según la reivindicación 39, donde el producto alimentario está procesado, precocinado o elaborado.