Obtención y propiedades antihipertensivas de péptidos derivados de proteínas de clara de huevo.

La invención consiste en la producción de la unidades peptídicas mínimas que presentan bio-actividad como agentes antihipertensivos a partir de clara de huevo sometida a un tratamiento enzimático. Dichos péptidos muestran actividad inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina (actividad IECA) in vitro y/o actividad antihipertensiva en ratas y/o actividad antioxidante. Estos ovoproductos: los hidrolizados completos, las fracciones de los mismos de bajo peso molecular, o sus péptidos constituyentes, podrían utilizarse como sustancias terapéuticas con actividad IECA y/o con actividad antihipertensiva y/o con actividad antioxidante, ya sea como productos alimentarios funcionales, aditivos o ingredientes alimentarios, o productos farmacéuticos, para el tratamiento y/o prevención de la hipertensión arterial en todas sus formas en un ser humano o en un animal y para el tratamiento y/ola prevención de cualquier desorden asociado con la hipertensión arterial en un ser humano o en un animal

Obtención y propiedades antihipertensivas de péptidos derivados de proteínas de clara de huevo.

Sector de la técnica

La invención consiste en la producción de péptidos con actividad antihipertensiva, derivados de proteínas de clara de huevo, que pueden aplicarse en la industria alimentaria y farmacéutica.

Estado de la técnica

Dentro de la secuencia de las proteínas alimentarias se encuentran determinadas regiones que, una vez liberadas mediante hidrólisis, pueden exhibir actividades biológicas. Dichos fragmentos, denominados péptidos bioactivos, pueden generarse in vivo, durante la hidrólisis de las proteínas por acción de las enzimas gastrointestinales, o in vitro, mediante la acción de enzimas específicas o durante los procesos de elaboración de determinados alimentos. Por su diversidad y multifuncionalidad, los péptidos bioactivos pueden emplearse como ingredientes en alimentos funcionales para producir distintos efectos beneficiosos para la salud, ya que ejercen diferentes actividades biológicas, tales como antihipertensiva, antitrombótica, opiácea, antioxidante, inmunomodulante etc. [Gobbetti, M., Stepaniak, L., de Angelis, M., Corsetti, A., di Cagno, R. Latent bioactive peptides in milk proteins: proteolytic activation and significance in dairy processing. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2002, 42:223-239].

La presión arterial se define como la fuerza ejercida por la sangre contra la pared arterial y, la hipertensión arterial se puede definir como una elevación crónica de la presión arterial sistólica (PAS) y/o de la presión arterial diastólica (PAD) por encima de los valores normales. Se trata de uno de los principales factores de riesgo de enfermedades cardiovasculares y la primera causa de mortalidad en los países desarrollados. De hecho, numerosos estudios han demostrado la estrecha relación entre la hipertensión arterial no tratada y la aparición de hipertrofia ventricular, insuficiencia renal progresiva, accidentes cerebrovasculares, retinopatías, enfermedades vasculares periféricas etc. El sistema renina-angiotensina juega un papel crucial en el control de la presión arterial y en el balance de electrolitos, y participa en las funciones renal, neuronal y endocrina. Existen fármacos con actividad antihipertensiva, como el Captopril, que actúan inhibiendo la enzima convertidora de angiotensina (ECA). La ECA cataliza la formación de angiotensina II, un octapéptido con una potente actividad vasoconstrictora y, además, inactiva la bradiquinina, que produce vasodilatación.

Se han descubierto distintos péptidos con actividad inhibidora de la ECA (IECA), derivados de hidrolizados enzimáticos de proteínas de suero lácteo, caseínas, músculo de pescado, huevo, o de origen vegetal [Yamamoto, N. Antihypertensive peptides derived from food proteins. Biopolymers, 1997, 43: 129-134; Fujita, H., Yamagami, T., Ohshima, K. Effects of an ACE-inhibitory agent, katsuobushi oligopeptide, in the spontaneously hypertensive rat and in borderline and middly hypertensive subjects. Nutr. Res. 2001, 21: 1149-1158; Vermeirssen, V., Van Camp., J., Decroos, K., Van Wijmelbeke, L., Verstraete W. The impact of fermentation and in vitro digestion on the formation of antiotensin-I-converting enzyme inhibitory activity from pea and whey protein. J. Dairy Sci. 2003, 86: 429-438]. En la mayor parte de los casos se ha probado que éstos péptidos actúan inhibiendo la ECA in vitro. En ocasiones se ha demostrado su actividad antihipertensiva, normalmente en ratas espontáneamente hipertensas (SHR), que constituyen un buen modelo animal para la evaluación de compuestos con actividad antihipertensiva, siendo los estudios en humanos mucho más escasos. Sin embargo, con frecuencia los péptidos con actividad IECA in vitro no muestran actividad antihipertensiva en ratas SHR [Fujita, H, Yokoyama, K., Yoshikawa, M. Classification and antihypertensive activity of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins. J. Food Sci. 2000, 65: 564-569]. Esto pone de manifiesto que la determinación de la actividad IECA in vitro, si bien es un buen punto de partida para estos estudios, no puede convertirse en el único criterio de selección, ya que no considera las transformaciones fisiológicas de los péptidos en el organismo que determinan su biodisponibilidad (digestión y paso a través de la barrera gastrointestinal para llegar a la sangre en forma activa).

Por otra parte, la inhibición de la ECA no es el único mecanismo que puede justificar la acción antihipertensiva de los péptidos derivados de proteínas alimentarias. La hipertensión esencial se asocia con una lipoperoxidación exagerada, y con un desequilibrio en el status antioxidante que conlleva a un exceso de formación de especies reactivas de oxígeno [Touyz, R. M., Pu, Q., He, G., Chen, X., Yao, G., Neves, M. F., Viel, E. Effects of a low dietary magnesium intake on development of hypertension in stroke-prone spontaneously hypertensive rats: role of reactive oxygen species. J. Hypertens. 2002, 20:2221-2232]. Algunos de estos péptidos tienen efecto antioxidante. Algunos también podrían ejercer una acción vasodilatadora directa. Así, se han descrito dos péptidos con actividad vasodilatadora, que provienen de la misma región de la ovoalbúmina hidrolizada con diferentes enzimas. Fujita y col. [Fujita, H., Usui, H., Kurahashi, K., Yoshikawa, M. Isolation and characterization of ovokinin, a bradykinin B1 agonist peptide derived from ovoalbumin. Peptides, 1995, 16: 785-790; Fujita, H., Sasaki, R., Yoshikawa, M. Potentiation of the antihypertensive activity of orally administered ovokinin, a vasorelaxing peptide derived from ovalbumin, by emulsification in egg phosphatidyl-choline. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995, 59: 2344-2345] encontraron que la ovokinina, un octapéptido aislado de un hidrolizado de ovoalbúmina con pepsina (FRADHPFL SEQ ID Nº 5) [Yoshikawa, M., Hasegawa, M., Fujita, H. 1993. New peptide and its production. JP5331190], mostraba actividad relajante en arterias mesentéricas caninas y actividad antihipertensiva cuando se administraba por vía oral a ratas SHR a dosis de 100 mg/kg. Matoba y col. [Matoba, N., Usui, H., Fujita, H., Yoshikawa, M. A novel anti-hypertensive peptide derived from ovalbumin induces nitric oxide-mediated vasorelaxation in an isolated SHR mesenteric artery. FEBS Lett. 1999, 452:181-184] purificaron a partir de un hidrolizado de ovoalbúmina con quimotripsina, un hexapéptido correspondiente al fragmento 2-7 de la ovokinina (RADHP SEQ ID Nº 4; ovokinina (2-7)) [Yoshikawa, M., Hasegawa, M., Yamamoto, T., Fujita, H. 1998. New peptide from egg white used for production of therapeutic for treatment of, e.g. angina pectoris. JP10036394] que ejercía una potente acción antihipertensiva en ratas SHR a dosis de 10 mg/kg.

Posteriormente, se sintetizaron análogos de la ovokinina (2-7) para aumentar su actividad antihipertensiva. Entre ellos, RPFHPF y RPLKPW, mostraron, respectivamente 10 y 100 veces más actividad que la ovokinina (2-7) tras su administración oral a SHR (dosis mínimas efectivas de 1 y 0.1 mg/kg), lo que se atribuyó a una mayor resistencia a las proteasas del tracto digestivo [Matoba, N., Yamada, Y., Usui, H., Nakagiri, R., Yoshikawa, M. Designing potent derivatives of ovokinin (2-7), an anti-hypertensive peptide derived from ovalbumin, Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001, 65: 736-739; Yamada, Y., Matoba, N., Usui, H., Onishi, K. Design of a highly potent anti-hypertensive peptide based on ovokinin (2-7), Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002, 66: 1213-1217]. De acuerdo con estos autores, la ovokinina (2-7), y sus derivados RPFHPF o RPLKPW disminuirían la presión arterial a través de su interacción con receptores del tracto gastrointestinal o debido a efectos en el sistema nervioso central.

En nuestro laboratorio hemos demostrado que la proteolisis de clara de huevo con pepsina da lugar a un hidrolizado con potente actividad IECA y neutralizadora de radicales libres in vitro, y con actividad antihipertensiva en ratas SHR, que podría dar lugar a preparados multifuncionales útiles para la prevención y el tratamiento de la hipertensión y otros desórdenes asociados [Miguel, M., López-Fandiño, R., Recio. I., Ramos, M., López-Fandiño, R., Aleixandre, A. 2003. Péptidos bioactivos derivados de proteínas de clara de huevo mediante hidrólisis enzimática. Solicitud Española de patente 200301829]. Se identificaron varias secuencias peptídicas activas, derivadas de la ovoalbúmina, mediante espectrometria de masas en tandem, síntesis química de los péptidos y confirmación de las propiedades IECA y antioxidantes de los fragmentos sintéticos [Miguel, M., Recio. I., Gómez-Ruiz,...

1. Producto bioactivo, seleccionado de entre el péptido SEQ. ID. Nº. 1 o el péptido SEQ. ID. Nº. 2, o cualquier derivado o sal farmacéuticamente aceptable, que tiene actividad antihipertensiva.

2. Composición farmacéutica que comprende el producto bioactivo según la reivindicación 1.

3. Aditivo, ingrediente o suplemento alimenticio funcional que comprende el producto bioactivo según la reivindicación 1.

4. Uso de un aditivo, ingrediente o suplemento alimenticio funcional según la reivindicación 3, en la elaboración de un producto alimenticio funcional para el tratamiento de la hipertensión.

5. Producto alimenticio funcional que comprende el producto bioactivo según la reivindicación 1.

6. Procedimiento para producir el producto bioactivo según la reivindicación 1, que comprende:

7. Procedimiento según la reivindicación 6, donde el material de partida se selecciona de la lista que comprende ovoproductos destinados a la alimentación humana, ovoproductos destinados a la alimentación animal, huevo entero, clara de huevo u ovoalbúmina pura.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, donde en el apartado (b), el material de partida se disuelve o dispersa en una solución tampón con un pH de entre 2.0 y 3.0, y la hidrólisis del apartado (c) se lleva a cabo por medio de pepsina.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, donde se mantiene la reacción de hidrólisis del apartado (c) durante un tiempo aproximado de 3 horas.

10. Procedimiento según la reivindicación 9 que además comprende:

11. Procedimiento para producir el producto bioactivo según la reivindicación 1, que comprende la síntesis química o enzimática de SEQ. ID. Nº. 1 o SEQ. ID. Nº. 2, o; el empleo de métodos recombinantes que contengan la secuencia SEQ. ID. Nº. 1 o SEQ. ID. Nº. 2.

12. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 2 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la hipertensión.