Modelo murino de lupus eritematoso sistémico, obtenido introduciendo el gen Lpr en un ratón C57BL/6J (B6) deficiente en Fc?RIIB

Modelo animal no humano del lupus eritematoso sistémico.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un modelo animal murino que desarrolla el lupus eritematoso sistémico, que es una enfermedad autoinmune sistémica, y un procedimiento de cribado para un agente terapéutico del lupus eritematoso sistémico utilizando dicho modelo murino del lupus eritematoso sistémico.

Antecedentes de la técnica

Los organismos vivos muestran reacciones alérgicas no sólo a sustancias extrañas del mundo exterior, sino también a sus propios componentes, dando lugar al desarrollo de alteraciones autoinmunes. Dichas alteraciones autoinmunes son enfermedades sistémicas que se dividen en enfermedades autoinmunes órgano-específicas tales como la anemia perniciosa, el síndrome de Good-pasture, la miastenia grave, la diabetes resistente a la insulina, la nefritis atrófica, la esclerosis múltiple y similares, y enfermedades autoinmunes no órgano-específicas tales como la artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, polimiositis y similares. Varios autoanticuerpos y linfocitos reactivos autoantigénicos se encuentran entre dichas enfermedades autoinmunes y ha constituido una importante cuestión cómo están actualmente relacionados con la alteración hística. El lupus eritematoso sistémico mencionado anteriormente (SLE) es una enfermedad autoinmune sistémica típica que muestra anormalidades inmunitarias como la expresión de autoinmunidad y similares, y la expresión de múltiples fallos orgánicos. Como causa de la enfermedad, se han señalado factores genéticos y la disfunción de las células T y B que provocan la generación de diversos autoanticuerpos, incluyendo principalmente el anticuerpo anti-ADN bicatenario (anticuerpo anti-ds ADN). Los síntomas clínicos actuales son varios, tales como los mucocutáneos, artritis, pleuritis/pericarditis, alteraciones neuropsiquiátricas y similares, y particularmente, la glomerulonefritis constituye una lesión importante que determina el pronóstico vital.

Convencionalmente, los ratones MRL/lpr se han presentado como un modelo murino típico del lupus eritematoso sistémico (Murphy ED, Roth JB. Autoimmunity and lymphoproliferation: Induction by mutant gene lpr, and acceleration by a male-associated factor in strain BXSB mouse. Genetic Control of Autoimmune Disease (editores Rose N, Bigazzi P, Warner N). Elsevier North Holland, New York, 1978, páginas 207-221), los ratones MRL/lpr constituyen ratones endógamos cruzando AKR/J, C57BL/6J, C3H/Di, y LG/J, que desarrollan espontáneamente artritis y glomerulonefritis. Se ha reconocido que el gen Lpr es un gen mutante autosómico recesivo que causa la proliferación de linfocitos, el cual es un mutante del gen antigénico Fas que induce la apoptosis, y que los ratones MRL/Lpr son deficientes en el gen del antígeno Fas (Watanabe-Fukunaga R, Brannan Cl, Copeland NG, Jelkins NA, Nagata S: Lymphoproliferation disorder in mice explained by defects in Fas antigen that mediates apoptosis. Nature 356: 314-317,1992; Takahashi, T., Tanaka, M., Brannan, C.I., Jenkins, N.A., Copeland, N.G., Suda, T., y Nagata, S. (1994). Generalized lymphoproliferative disease in mice, caused by a point mutation in the Fas ligand. Cell 76, 969-976). Aunque la proliferación anormal de las células T y B/supergeneración de inmunoglobulinas y sus mecanismos detallados se desconocen, se ha informado de que la generación de varios autoanticuerpos (anticuerpos anti-ADN, anticuerpo anti-Sm y similares), puede inducirse de la misma forma que en las enfermedades humanas (Izui S, Eisenberg RA: Circulating anti-DNA-rheumatoid factor complex in MRL/1 mice. Clin. Immunol. Immunopathological 15: 436-551, 1980; Gyotoku Y, Abdelmoula M, Spertini F, Izui S, Lambert P-H: Crioglobulinemia induced by monoclonal immunoglobulin G rheumatoid factors derived from autoimmune MRL/Mpj-lpr/lpr mice. J. Immunol 138: 3785-3792,1987). Además, los ratones MRL/plr son ratones en los que se mezclan distintos haplotipos tal como se menciona anteriormente, y es conocido que si se someten a retrocruzamiento en ratones de una cepa que desarrolla espontáneamente anormalidad autoinmune (C3H/HeJ, C57BL/6, AKR), enfermedades tales como la nefritis y la artritis no se desarrollan, aunque puede observarse la generación de autoanticuerpos (Theofilopoulos, A.N. y F.J. Dixon: Murine models of systemic lupus erythematosus, Adv. Immunol. 37: 269-390,1985). Por tanto, sus antecedentes genéticos se consideran estrechamente relacionados con la patología autoinmune de MRL/lpr. Por otra parte, la solicitud de patente japonesa sometida a examen nº 9-172908 da a conocer vertebrados transgénicos no humanos de lupus eritematoso sistémico, en los que se incorpora una estructura genética que incluye el gen IL-1a.

La predisposición genética desempeña un papel crucial en la susceptibilidad al lupus eritematoso sistémico (SLE) tanto en pacientes humanos como en modelos animales. Los genes en múltiples vías parecen participar en elementos específicos de la enfermedad, y las interacciones epistáticas entre estos genes juegan un papel importante tanto en el agravamiento como en la supresión del desarrollo de la enfermedad. (EDWARD K, IMMUNITY, vol 15, nº 3, 23 septiembre de 2001, páginas 397-408).

El FcgammaRIIB es un potente gen para la susceptibilidad al lupus, tal como se demuestra por la observación de que los ratones que son deficientes en esta molécula desarrollan anticuerpos antinucleares espontáneos y glomerulonefritis fatal cuando se encuentran en los ancestros de C57BU6. Los híbridos entre FcgammaRIIB (^-/-) y el lupus eritematoso sistémico (SLE) modifican yaa y lpr y el locus Sle 1 para la susceptibilidad. Los heterocigotos de Sle1 y B6.RIIB(^-/-)desarrollan la enfermedad significativamente, mientras que los heterocigotos simples no muestran evidencia de la enfermedad o de autoinmunidad, indicando que estos genes se encuentran en idéntica vía genética que da lugar a la pérdida de la tolerancia a los antígenos nucleares. Sin embargo, la generación de anticuerpos antinucleares en sí misma es insuficiente para considerar la gravedad de la enfermedad autoinmune en este modelo, tal como se ha demostrado por el análisis de los híbridos yaa y lpr. Así, los ratones B6.RIIB(^-/-)/lpr están protegidos de la progresión de la enfermedad, a pesar de títulos equivalentes de anticuerpos antinucleares. Otros loci recesivos a los que contribuye el genoma C57BU6 son necesarios para el fenotipo de los anticuerpos antinucleares, indicando además las propiedades epistáticas de este modelo SLE (Bolland S., IMMUNITY, vol 13, nº 2, agosto del 2000, páginas 277-285).

El objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un modelo murino de lupus eritematoso sistémico, en el que se induce la generación de anticuerpos anti-ADN bicatenario y de anticuerpos anti-ADN monocatenario y que desarrolla espontáneamente artritis y glomerulonefritis; y un procedimiento de cribado de un agente terapéutico para el lupus eritematoso sistémico utilizando dicho modelo murino de lupus eritematoso sistémico.

En el contexto de la presente invención, se realizó un intenso estudio para resolver el problema mencionado, y retrocruzaron durante 12 generaciones de ratón deficiente FC?RIIB que no desarrollaron una patología autoinmune espontáneamente aunque se mejoraron sus diversas respuestas de anticuerpos, en los que la función genética de FcyRIIB que es FcR inhibitoria es deficiente en su cromosoma, en ratones C57BL/6J (B6), los cuales son un haplotipo H-2b, para generar ratones B6 deficientes en FC?RIIB). Dichos ratones FC?RIIB deficientes no desarrollan espontáneamente una patología autoinmune, aunque sus diversas respuestas de anticuerpos se potencian, y en ellos, la función genética de FC?RIIB que es FCR inhibitoria, es deficiente en su cromosoma. Después de obtener los ratones B6 FC?RIIB deficientes, se cruzaron ratones machos B6 FC?RIIB deficientes con ratones hembra Lpr/B6 para generar ratones FC?RIIB^+/-/lpr^+/-, en los que ambos genes son heterocigóticos; posteriormente, cruzaron los ratones FC?RIIB^+/-/lpr^+/- para generar ratones lpr/B6 FC?RIIB (FC?RIIB^-/-/lpr^+/+= FC?RIIB^-/-/lpr). Los ratones B6 deficientes en Fc?RIIBs viven poco tiempo, comparados con los ratones salvajes, en los que se observa una notable proliferación de linfocitos, siendo los títulos de anticuerpos anti-ADN significativamente altos. Además, la glomerulonefritis se desarrolla el 100% espontáneamente en los animales con una edad de 16 semanas, desarrollándose el 100% espontáneamente la artritis en los ratones con 24 semanas de edad, habiendo encontrando de...

1. Modelo murino de lupus eritematoso sistémico, obtenido introduciendo el gen Lpr en un ratón C57BL/6J (B6) deficiente en Fc?RIIB.

2. Modelo murino de lupus eritematoso sistémico según la reivindicación 1, en el que el gen Lpr se introduce realizando un cruzamiento entre un ratón C57BL/6J deficiente en Fc?RIIB, y un ratón Lpr/B6, y realizando un entrecruzamiento entre los ratones heterocigóticos resultantes.

3. Procedimiento de cribado de un agente terapéutico para el lupus eritematoso sistémico, en el que se administra una sustancia de prueba al modelo murino del lupus eritematoso sistémico según la reivindicación 1 ó 2, y son medidos y evaluados el cambio en la esperanza de vida media, en los tejidos, órganos o células, y/o el cambio en el título de anticuerpos antinucleares en suero.

4. Procedimiento de cribado de un agente terapéutico para el lupus eritematoso sistémico, en el que un tejido, un órgano, o las células derivados del modelo murino del lupus eritematoso sistémico según la reivindicación 1 ó 2, se ponen en contacto con una sustancia de prueba, y el cambio en tejidos, órganos o células es medido y evaluado.

5. Procedimiento de cribado de un agente terapéutico para el lupus eritematoso sistémico según la reivindicación 3 ó 4, en el que el cambio en los tejidos o en los órganos es un cambio renal o en la articulación de las patas.

6. Procedimiento de cribado de un agente terapéutico para el lupus eritematoso sistémico según la reivindicación 3 ó 4, en el que el cambio en las células es un cambio en la proliferación o disminución de las células B, o un cambio en la diferenciación de las células B.

7. Procedimiento de cribado de un agente terapéutico para el lupus eritematoso sistémico según la reivindicación 6, en el que las células B proceden de las células abdominales o esplénicas.

8. Procedimiento de cribado de un agente terapéutico para el lupus eritematoso sistémico según la reivindicación 3, en el que el cambio en el título de los anticuerpos antinucleares en el suero es un cambio en el título de los anticuerpos anti-ADN bicatenario y/o en el título de los anticuerpos anti-ADN monocatenario en el suero.

9. Procedimiento de cribado de un agente terapéutico para el lupus eritematoso sistémico según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en el que el caso del modelo murino del lupus eritematoso sistémico según la reivindicación 1 ó 2, se compara con el caso de un ratón de tipo salvaje y es evaluado.