PROCEDIMIENTOS DE ESTUDIO DE LA TOLERANCIA EN ANIMALES TRANSGÉNICOS MHC-II.

Un procedimiento para probar la inmunogenicidad de un antígeno variante que se deriva de un antígeno de un primer mamífero,

en un segundo mamífero no humano, en el que i. dicho segundo mamífero es transgénico para moléculas MHC de clase II derivadas de dicho primer mamífero; y ii. dicho primer y segundo mamíferos son de diferentes especies; comprendiendo dicho procedimiento (a) poner en contacto dicho segundo mamífero con el antígeno del primer mamífero de manera que dicho segundo mamífero se vuelva tolerante a dicho antígeno; (b) poner en contacto dicho segundo mamífero tolerizado con dicho antígeno variante; y (c) medir la inmunogenicidad de dicho antígeno variante en dicho segundo mamífero

La presente invención se refiere a sistemas in vivo para probar la inmunogenicidad de variantes de proteínas. En particular, la invención se refiere a procedimientos que usan ratones transgénicos para moléculas MHC de clase II humano en los que tales ratones se hacen tolerantes a una proteína específica y luego se prueban con variantes de la proteína específica para la inducción de inmunogenicidad. Además, la presente invención se refiere a sistemas in vivo para seleccionar proteínas de una biblioteca de variantes de proteínas para inmunogenicidad reducida mediante los cuales ratones transgénicos MHC tolerizados se inyectan con bibliotecas de líneas celulares o partículas asociadas a diferentes proteínas variante seleccionándose in vivo líneas celulares específicas o partículas asociadas a proteínas variante con menor inmunogenicidad que otras proteínas en la biblioteca.

Los procedimientos actuales para probar proteínas farmacéuticas candidatas para posible inmunogenicidad en seres humanos están principalmente limitados porque las especies no humanas tienen moléculas de MHC (antígeno de histocompatibilidad mayor) diferentes de las de los seres humanos y, por tanto, las respuestas inmunitarias a proteínas inyectadas en animales de prueba no reflejan futuras respuestas inmunitarias a las mismas proteínas en seres humanos. Por tanto, es importante probar proteínas para inmunogenicidad usando tanto células humanas como células con MHC humano. Un enfoque particularmente valioso es probar proteínas en ensayos de proliferación de linfocitos T usando muestras de sangre humana. Sin embargo, este enfoque mide respuestas de linfocitos T a la proteína de prueba in vitro y hasta ahora se han demostrado procedimientos de inmunogenicidad no in vitro que producen la producción de anticuerpos como se producen in vivo. Enfoques alternativos podrían usar ratones tanto reconstituidos con linfocitos T y B humanos como ratones transgénicos en los que el MHC de ratón residente y, en algunos casos, las moléculas receptoras de linfocitos T, han sido sustituidos por homólogos humanos. Sin embargo, estos enfoques pueden no producir una predicción exacta de la inmunogenicidad en seres humanos debido a que no tienen en cuenta la tolerancia, especialmente la tolerancia en el sistema inmunitario humano a proteínas humanas normales. Por ejemplo, se esperaría que un ratón transgénico para MHC organizara una respuesta inmunitaria contra una proteína humana inyectada debido a que el ratón no sería tolerante a una proteína humana tal. Por tanto, existe la necesidad de procedimientos mejorados para facilitar la prueba de inmunogenicidad in vivo de proteínas y variantes de proteínas que tienen en cuenta la tolerancia normal a proteínas en la especie.

Wierda y col., Toxicology, 158 (2001), pág. 71-76, desvelan que ratones transgénicos tolerantes a proteínas humanas específicas pueden usarse para cribar variantes de proteínas humanas que no son inmunogénicas.

Geluka y col., Biotherapy, 10 (1998), pág. 191-196, desvelan cómo los ratones transgénicos HLA proporcionan un sistema modelo para uso en el desarrollo de ligandos de proteínas alterados en ratones.

Por tanto, en un primer aspecto la presente invención proporciona un procedimiento para probar la inmunogenicidad de un antígeno variante que se deriva de un antígeno de un primer mamífero, en un segundo mamífero no humano, en el que

i. dicho segundo mamífero es transgénico para moléculas MHC de clase II derivadas de dicho primer mamífero; y

ii. dicho primer y segundo mamíferos son de diferentes especies;

comprendiendo dicho procedimiento

(a) poner en contacto dicho segundo mamífero con el antígeno del primer mamífero de manera que dicho segundo mamífero se vuelva tolerante a dicho antígeno;

(b) poner en contacto dicho segundo mamífero tolerizado con dicho antígeno variante; y

(c) medir la inmunogenicidad de dicho antígeno variante en dicho segundo mamífero.

Se desvelan sistemas in vivo para probar, por ejemplo, la inmunogenicidad de proteínas y variantes de proteínas. Como se trata en este documento, el antígeno variante se deriva de un antígeno de mamífero. Los antígenos variantes pueden incluir secuencias de proteínas o de polipéptidos que tienen adiciones, deleciones o sustituciones

o que se han derivatizado por medios químicos. El antígeno no es del mamífero transgénico no humano usado en el procedimiento.

En particular, la invención se refiere a procedimientos que usan ratones transgénicos para moléculas MHC de clase II humano que permiten la presentación de epítopes de linfocitos T humanos y la prueba de posible inmunogenicidad a proteínas humanas y variantes de proteínas en un origen de ratón.

En una realización de la presente invención, la tolerancia a una proteína humana se induce en ratones neonatales que expresan genes MHC de clase II humano de la línea germinal (HLA-tg) inyectando bajas concentraciones (por ejemplo, equivalentes a cantidades fisiológicas encontradas en suero humano y/u otros tejido) de proteína. Las proteínas son preferentemente monoméricas y se administran intravenosamente en un tampón inmunológicamente 'inerte' tal como solución salina o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En tales sistemas, la frecuencia de dosis para inducir la tolerancia variará dependiendo de la proteína a la que se induce tolerancia. Por ejemplo, las proteínas normalmente presentes a altas concentraciones en suero necesitan administrarse muy probablemente más frecuentemente para inducir tolerancia que aquellas normalmente encontradas a bajas concentraciones fisiológicas.

Preferentemente se usarán ratones inmaduros (por ejemplo, ratones neonatales) con el fin de garantizar que la proteína tolerizante esté presente durante el desarrollo de linfocitos T y, por tanto, induzca tolerancia central.

Normalmente, a los ratones de hasta 6 semanas de edad se les darán administraciones repetidas cuando disminuya la producción de linfocitos T CD4+ y CD8+ maduros del timo (normalmente edad adulta). Habiendo establecido la tolerancia a la proteína de prueba o formas invariantes de las proteínas variante de prueba, los ratones tolerizados se inyectarán entonces con la proteína de prueba o variantes de proteínas y posteriormente se probarán para inmunogenicidad contra la proteína de prueba o variantes de proteínas. En ratones con genes de inmunoglobulina intactos, la inmunogenicidad puede medirse mediante la producción de anticuerpos contra la proteína de prueba o variantes de proteínas. Alternativamente pueden realizarse otros ensayos relacionados con la inmunogenicidad tales como ensayos para medir las respuestas de linfocitos T o B específicos para la proteína de prueba usando sangre periférica, bazo o parche de Peyer de ratones HLA-tg tolerizados.

En otra realización de la presente invención, la tolerancia se induce en ratones retrocruzando ratones HLA-tg humanos con ratones que expresan un transgén humano para la proteína de interés. Por ejemplo, pueden producirse ratones HLA-tg humanos que expresan IgG humana que son tolerantes a IgG humana. Si la IgG humana no se expresa de una forma tal que se permita la mutación somática de la región variable (V), translocalización o transposiciones, o cambio en la región constante (C) por cambio de clase, entonces estos ratones serán tolerantes a las secuencias de IgG humanas específicas expresadas, pero intolerantes a cierta mutación somática de la región variable V, translocalización o transposiciones o cambio en la región C por cambio de clase. Si la IgG humana se expresa de tal forma que se permita la mutación somática de la región variable V, translocalización o transposiciones o el cambio de clase de la región de C, entonces estos ratones no sólo no serán tolerantes a una IgG humana específica que contiene una secuencia de la región V y C de la línea germinal específica, sino también a IgG humana que ha experimentado maduración por afinidad y es específica para cualquier antígeno.

Bajo estas condiciones es posible producir un ratón transgénico que expresa MHC de clase II humano endógeno y una proteína humana para la que puede lograrse la tolerancia central en el contexto de MHC de clase II humano. El número de copias del transgén humano (que codifica la proteína humana de interés) incorporadas en el genoma de ratón o la eficiencia de expresión del transgén (determinada por diferentes factores tales como la eficiencia de transcripción y traducción, y la localización de transgenes... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para probar la inmunogenicidad de un antígeno variante que se deriva de un antígeno de un primer mamífero, en un segundo mamífero no humano, en el que

i. dicho segundo mamífero es transgénico para moléculas MHC de clase II derivadas de dicho primer mamífero; y

ii. dicho primer y segundo mamíferos son de diferentes especies; comprendiendo dicho procedimiento

(a) poner en contacto dicho segundo mamífero con el antígeno del primer mamífero de manera que dicho segundo mamífero se vuelva tolerante a dicho antígeno;

(b) poner en contacto dicho segundo mamífero tolerizado con dicho antígeno variante; y

(c) medir la inmunogenicidad de dicho antígeno variante en dicho segundo mamífero.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el contacto con el antígeno va a lograrse introduciendo en dicho segundo mamífero uno o más constructos de expresión que codifican el antígeno de mamífero.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho antígeno es una proteína soluble.

4. Un procedimiento según la reivindicación 3, en el que dicho antígeno es una proteína humana soluble.

5. Un procedimiento según la reivindicación 3, en el que dicho antígeno es un anticuerpo monoclonal y en el que dicho segundo mamífero se pone en contacto con una forma monomérica soluble del mismo.

6. Un procedimiento según la reivindicación 3, en el que dicho antígeno es una preparación de anticuerpo policlonal de mamífero y en el que dicho segundo mamífero se pone en contacto con una forma soluble del mismo

7. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que la proteína está en adyuvante.

8. Un procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para su uso para probar vacunas humanas.

9. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el mamífero no humano es un roedor.

10. Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que el roedor es un ratón y las moléculas MHC de clase II de mamífero son humanas, por ejemplo, HLA-DR humano.

11. Un procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicho ratón transgénico es un ratón neonatal puesto en contacto con dicho antígeno hasta 6 semanas, pero preferentemente en el plazo de 32 horas desde el nacimiento con el fin de inducir tolerancia a dicho antígeno.

12. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el antígeno de mamífero es un antígeno humano.

13. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el antígeno de mamífero es un antígeno no humano.

14. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que dicho ratón transgénico se modifica para eliminar o convertir en inactivo cualquier gen de ratón que expresa dicho antígeno o variantes de dicho antígeno.

15. Un procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicho ratón transgénico se convierte entonces en tolerante a dicho antígeno, cuyo antígeno es una proteína de no ratón, antes de exponerse a y la medición de la inmunogenicidad de una o más variantes de la proteína de no ratón.

16. Un procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicha proteína de no ratón es inmunoglobulina humana y dicha(s) proteína(s) de variante son anticuerpos monoclonales o policlonales de prueba.

17. Un procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicho ratón transgénico codifica cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina humana.

18. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, en el que la inmunogenicidad se mide usando suero de dicho mamífero transgénico para probar la inducción de anticuerpos contra los anticuerpos monoclonales o policlonales de prueba o proteínas de prueba.

19. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, en el que la inmunogenicidad se mide con ensayos de proliferación de linfocitos T o de activación de linfocitos T usando sangre o muestras de tejido de ratón como fuente de linfocitos T de ratón.

20. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, en el que la inmunogenicidad humana

5 se mide probando la producción de linfocitos T reactivos para proteína, por ejemplo, mediante la unión de complejos de péptido-MHC específicos, probando linfocitos T o B midiendo la producción de citocinas, proliferación, expresión de marcadores de la superficie celular, flujo de Ca2+, PCR o huella de ADN o probando la aparición de linfocitos B o T reactivos inmunitarios específicos.

21. El uso de un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 para probar la inmunogenicidad 10 de una biblioteca de antígenos variantes.

22. El uso según la reivindicación 21, en el que los antígenos variantes son antígenos humanos.

23. El uso según la reivindicación 22, en el que los antígenos humanos son proteínas.

24. El uso según la reivindicación 21, en el que los antígenos variantes son antígenos no humanos.

25. El uso según la reivindicación 24, en el que los antígenos no humanos son proteínas.

15 26. El uso según la reivindicación 23, en el que las proteínas son una biblioteca de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.

27. El uso según la reivindicación 21, en el que los antígenos humanos de variante se seleccionan directamente probando anticuerpos inducidos por la mezcla de antígenos humanos de variante para determinar los anticuerpos inducidos por antígenos humanos de variante individuales o preabsorbiendo la mezcla de antígenos humanos de variante con anticuerpos inducidos por la mezcla.

28. El uso según la reivindicación 21, en el que los antígenos humanos de variante están unidos a partículas y tales partículas se usan para identificar variantes individuales.

29. El uso según la reivindicación 21, en el que los antígenos humanos de variante están unidos a células vivas y tales células vivas se usan para identificar variantes individuales.

25 30. El uso según las reivindicaciones 21 y 27-29, en el que uno o más antígenos variantes se derivan de un anticuerpo.