BLOQUEO DE LA MIGRACIÓN DE LEUCOCITOS Y DE LA INFLAMACIÓN POR INTERFERENCIA CON CD99/HEC2.

Bloqueo de la migración de leucocitos y de la inflamación por interferencia con CD99/HEC2 Campo de la invención La presente invención se refiere a la inhibición de procesos inflamatorios, en particular, a la modulación de la migración transendotelial de leucocitos, y a composiciones para bloquear la migración transendotelial de leucocitos. Antecedentes de la invención Las referencias citadas a lo largo de esta memoria descriptiva con números se indican al final de los Ejemplos en la sección REFERENCIAS Ciertos estudios previos (1-1.2) han demostrado un papel crucial de la molécula de adhesión de plaquetas/células endoteliales-1 [PECAM] en la migración transendotelial [MTE] de los neutrófilos [PMN], monocitos [Mo] y células asesinas naturales [NK]. Sin embargo, incluso en las circunstancias más favorables, los reactivos anti-PECAM bloquean únicamente un 80-90 % de la entrada de leucocitos. Aunque éste es un bloqueo de la inflamación tan bueno o mejor que el que se ha conseguido fijando como objetivo una sola molécula, el 10-20 % residual de leucocitos que no se bloquean puede representar una población clínicamente significativa en condiciones crónicas. Además, hay al menos algunos modelos inflamatorios en los que parece no intervenir PECAM. Lo que es más importante para la presente invención es que puede haber etapas en la MTE que están mediadas por moléculas distintas de PECAM, que aún no se han descubierto. Migración de leucocitos en la inflamación La migración de leucocitos a un sitio de inflamación implica varias etapas mediadas por varias familias de moléculas de adhesión. Los presentes inventores se han centrado en la etapa de migración transendotelial [MTE] porque es la etapa en la que los leucocitos se destinan de forma irreversible a entrar en los tejidos inflamados. Los presentes inventores previamente han descrito el papel crítico de PECAM, expresada en las superficies de todos los Mo y PMN y concentrada en los bordes de las células endoteliales, en la MTE. En las condiciones mejor controladas, los reactivos anti-PECAM bloquean el 80-90 % de la MTE en modelos in vitro y en muchos modelos in vivo. Sin embargo, hay sistemáticamente al menos un 10-20 % de leucocitos que escapan a este bloqueo (1, 2, 4, 6, 8). Además, se ha descrito al menos un modelo in vivo en el que los anticuerpos contra PECAM no tienen ningún efecto (9). La deleción dirigida de PECAM da como resultado ratones sin defectos significativos en su respuesta inflamatoria aguda (26). Por lo tanto, existen mecanismos de MTE independientes de PECAM. El conocimiento de estos mecanismos conducirá a una mejor comprensión de la inflamación. La fijación como objetivo de estas rutas puede ser una ayuda útil para terapias antiinflamatorias centradas en PECAM. Etapas diseccionables molecularmente en la migración de leucocitos La respuesta inflamatoria es un arma de doble filo. La movilización de leucocitos a un foco de inflamación es crítica para la rápida resolución de infecciones y la restauración de daños tisulares debidas a una diversidad de lesiones. Por otra parte, la mayoría de las patologías humanas se deben a una inflamación que está mal dirigida o prolongada con el resultado de que se dañan tejidos del huésped. Los ejemplos comunes incluyen las artropatías inflamatorias, la fibrosis pulmonar y la aterosclerosis, que actualmente se considera una enfermedad inflamatoria crónica de la pared arterial (13). Por lo tanto, se ha dirigido mucha atención hacia la comprensión de la inflamación a nivel molecular con la esperanza de poder regularla mejor. El proceso de migración de leucocitos se ha diseccionado en una serie de acontecimientos de adhesión secuenciales en el siguiente modelo de trabajo [véase la Figura 1]. La migración de leucocitos se puede dividir en estas etapas porque se dispone de reactivos que pueden bloquear cada una de estas etapas. Puede haber moléculas de adhesión adicionales que aún no se han descubierto que interaccionen en etapas intermedias o distales a éstas. De hecho, CD99 puede ser una molécula de este tipo. Rodamiento. En la primera etapa, algunos de los leucocitos que entran en una vénula postcapilar en el área de inflamación dejan el torrente circulatorio y se adhieren ligeramente, provisionalmente y de forma reversible a las superficies de las células endoteliales en un proceso denominado acertadamente rodamiento. La familia de selección de moléculas de adhesión y sus ligandos decorados con Lewis x sialilados parecen ser los principales responsables de esta interacción inicial [revisado en (14, 15)]. Los leucocitos rodantes entran en contacto directo con el endotelio, exponiéndose a una diversidad de señales capaces de promover la siguiente etapa - activación de las integrinas específicas de leucocito. La unión de leucocitos a la propia E-selectina puede ser una señal suficiente (16). Como alternativa o adicionalmente, los leucocitos encadenados por las selectinas ahora están en una posición a activar por el factor de activación de plaquetas (17) u otros moduladores de lípidos (18), quimiocinas unidas a glucosaminoglicanos de la superficie endotelial (19), quimioatrayentes solubles (20) o ligandos que entrecruzan CD31 de leucocitos (3, 21, 22). Adhesión. Tras la activación de sus integrinas al estado de unión de alta afinidad, los leucocitos detienen el 2   rodamiento y se adhieren fuertemente a la superficie endotelial. En el caso de los monocitos y linfocitos, que expresan integrinas tanto de la familia ß1 como de la familia ß2, el acoplamiento por cualquier integrina puede ser suficiente para promover la unión para una transmigración posterior (23). Los contra-receptores identificados para la adhesión mediada por integrina ß1 e integrina ß2 incluyen ICAM-1, ICAM-2 y VCAM-1, miembros de la superfamilia de genes de inmunoglobulina. Los leucocitos unidos fuertemente a la superficie luminal de las células endoteliales avanzan rápidamente a una unión intercelular, un proceso que requiere ciclos de adhesión y separación sucesivos, ya que los leucocitos se unen por sus extremos delanteros y se sueltan por su parte posterior. Transmigración. Después de alcanzar la unión, insertan pseudópodos entre células endoteliales fuertemente yuxtapuestas y avanzan lentamente, de una forma ameboide, mientras que mantienen contactos fuertes con la célula endotelial. Esta etapa se denomina diapédesis, migración transendotelial [MTE] o transmigración. La molécula de adhesión de plaquetas/células endoteliales-1 [PECAM, también conocida como CD31], una CAM de la superfamilia de las inmunoglobulinas (24), expresada en las superficies de los leucocitos y las plaquetas y concentrada en los bordes entre células endoteliales, está implicada en esta etapa. El contacto entre la PECAM de leucocitos y la PECAM endotelial es crucial para la transmigración de la inmensa mayoría de neutrófilos y monocitos in vitro (1) e in vivo (2, 8). Se puede inhibir la MTE in vitro e in vivo mediante la administración de agentes que interfieran con la interacción homofílica de la PECAM de leucocitos con la PECAM endotelial. Estos incluyen mAc que se unen al dominio 1 y/o 2 de PECAM y bloquean este sitio crítico, o quimeras de PECAM-IgG recombinantes solubles que contienen al menos el dominio 1, que inhiben competitivamente esta interacción (4, 6, 25). Por lo tanto, la transmigración dependiente de PECAM es una diana prometedora para una terapia antiinflamatoria. En resumen, aunque los presentes inventores han aprendido mucho sobre las moléculas y mecanismos de rodamiento de leucocitos y adhesión a la superficie apical del endotelio (15, 46, 47), sigue habiendo un gran vacío en el conocimiento actual de la migración transendotelial. La PECAM claramente desempeña un papel importante en la MTE para la mayoría de PMN y monocitos en la mayoría de los estados inflamatorios estudiados hasta la fecha. La función de la PECAM en la mediación de la transmigración sin afectar a la adhesión apical define la MTE como una etapa separada en la migración de los leucocitos. Sin embargo, aunque la PECAM es la única molécula que se ha identificado que desempeña un papel especial en la MTE, claramente no es la única molécula implicada en la MTE. CD99 CD99 lo descubrieron y estudiaron independientemente cuatro grupos separados de investigadores. Los genetistas lo identificaron como el único gen pseudoautosómico humano conocido; su producto génico define el tipo sanguíneo Xg(a+). De forma similar al caso del grupo sanguíneo Duffy, los individuos Xg(a-) carecen de CD99 en sus glóbulos rojos (GR), pero lo expresan de forma apropiada en otros tipos celulares. Este gen está localizado en el extremo distal del brazo corto del cromosoma X, una región implicada en el emparejamiento con una región homóloga corta del cromosoma Y durante la meiosis. Debido... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo anti-CD99 que inhibe la migración transendotelial (MTE) de leucocitos mediada por CD99, para uso en un procedimiento para el tratamiento de una estado inflamatorio. 2. El anticuerpo anti-CD99 de la reivindicación 1, para el uso de la reivindicación 1, en el que la MTE se produce a través de células endoteliales en un tejido seleccionado del grupo que consiste en endotelio arterial, endotelio venoso, endotelio capilar, endotelio venular y endotelio venular postcapilar. 3. El anticuerpo anti-CD99 de la reivindicación 1, para el uso de la reivindicación 1, en el que el estado inflamatorio es un estado inflamatorio agudo. 4. El anticuerpo anti-CD99 de la reivindicación 1, para el uso de la reivindicación 1, en el que el estado inflamatorio se produce por una infección. 5. El anticuerpo anti-CD99 de la reivindicación 1, para el uso de la reivindicación 1, en el que el estado inflamatorio es un estado inflamatorio crónico. 6. El anticuerpo de la reivindicación 1 para el uso de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo anti-CD99 es un anticuerpo monoclonal que se ha modificado para ser un anticuerpo monoclonal humanizado, un fragmento Fab o F[ab]2, o un anticuerpo monoclonal quimérico. 7. Un procedimiento in vitro para modular la migración transendotelial (MTE) de leucocitos, comprendiendo dicho procedimiento inhibir la transmigración de leucocitos mediada por CD99 a través del endotelio usando un anticuerpo anti-CD99. 8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la CD99 está localizada sobre células endoteliales. 9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la CD99 está localizada sobre los leucocitos. 10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la MTE se produce entre células endoteliales activadas. 11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que las células endoteliales activadas se activan como resultado del contacto con una citocina proinflamatoria seleccionada del grupo que consiste en factor de necrosis tumoral (TNF) e interleucina-1 (IL-1). 12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que las células endoteliales se encuentran sobre tejido endotelial escindido mantenido en un cultivo de tejidos. 13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que las células endoteliales se cultivan in vitro sobre una membrana permeable. 14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que las células endoteliales son células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). 15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la MTE se produce a través de células endoteliales en un tejido seleccionado del grupo que consiste en endotelio arterial, endotelio venoso, endotelio venular y endotelio venular postcapilar. 16. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la inhibición de la MTE mediada por CD99 comprende poner en contacto los leucocitos, el endotelio o ambos con el anticuerpo. 17. El procedimiento de la reivindicación 7, o el anticuerpo de la reivindicación 1 para el uso de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo anti-CD99 es una molécula de anticuerpo monoclonal que se une a CD99 sobre monocitos, plaquetas y granulocitos. 18. Un procedimiento para seleccionar compuestos que inhiben la migración transendotelial mediada por CD99 de leucocitos, comprendiendo dicho procedimiento cultivar leucocitos y células endoteliales in vitro en presencia de un compuesto en condiciones que promueven la transmigración de leucocitos, e identificar un compuesto que inhibe la unión de leucocitos a células endoteliales e inhibe la transmigración de leucocitos. 19. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, que comprende además detectar el grado de transmigración de leucocitos entre células endoteliales. 20. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el compuesto se une a CD99. 21. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en el que las células endoteliales se encuentran sobre tejido endotelial escindido mantenido en un cultivo de tejidos.   22. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en el que las células endoteliales se cultivan in vitro sobre una membrana permeable. 23. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en el que las células endoteliales son células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). 36   Selectinas y mucinas integrinas 37   38   39     41