Epítopos peptídicos reconocidos por linfocitos T CD4+ estimulados por enfermedad.

Un péptido aislado que se une a HLA-DR4, que consiste en la secuencia de aminoácidos:

(1) YLKNVQTQETRTL (SEC ID Nº 10);

(2) YLKNVQTQETRTLTQ (SEC ID Nº 13); o

(3) FYLKNVQTQETRTLTQFHF (SEC ID Nº 16).

Epítopos peptídicos reconocidos por linfocitos T CD4+ estimulados por enfermedad Antecedentes de la invención La invención pertenece al campo de las enfermedades con etiología inmunológica, en particular enfermedades que implican a los linfocitos T CD4+.

Tras la internalización y procesamiento proteolítico de antígenos proteicos intactos por las células presentadoras de antígenos (CPA) , las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II sobre las CPA se unen a péptidos antigénicos cortos (epítopos) derivados de los antígenos y presentan los péptidos unidos a los linfocitos T CD4+ [Germain, R.N. (1994) , Cell 76:287 -299]. Los genes del MHC de clase II y las moléculas que codifican son muy variables entre individuos y las diferencias entre las moléculas del MHC de clase II tienen profundos efectos sobre qué péptidos se seleccionan para su presentación como epítopos de los linfocitos T. Las diferentes formas (alelos) de las moléculas del MHC de clase II expresadas por un individuo tienen un efecto fundamental sobre la susceptibilidad del individuo a una serie de enfermedades mediadas por los linfocitos T CD4+, de forma muy destacada enfermedades autoinmunes tales como la diabetes mellitus dependiente de insulina (DMDI) [Davies y col. (1994) , Nature 371:130 -136]. Es importante que los epítopos antigénicos de los antígenos reconocidos por los linfocitos T CD4+ que participan en estas enfermedades se definan con el fin de desarrollar productos y protocolos profilácticos y/o terapéuticos eficaces.

Honeyman et al., (Molecular Medicine, 4 231 -239, 1998) y Lohmann et al., (Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes, 107, 166 -171, 1999) divulgan una serie de péptidos IA-2 que provocan respuestas inmunológicas más débiles en pacientes en comparación con los péptidos de la presente invención.

Sumario de la invención La invención presenta epítopos peptídicos que activan las respuestas de los linfocitos T CD4 + que participan en la iniciación, promoción o exacerbación de ciertas enfermedades, especialmente aquellas en las que la susceptibilidad viene determinada por la expresión de moléculas de MHC de clase II definidas. La invención se basa en el descubrimiento de que la unión artificial de una molécula polipeptídica a la membrana celular de una CPA facilita el transporte de la molécula a los orgánulos que procesan el antígeno de la CPA. La invención está dirigida a péptidos derivados del autoantígeno de la diabetes IA-2.

La invención es un péptido aislado que se une a HLA-DR4, que consiste en la secuencia de aminoácidos:

(1) YLKNVQTQETRTL (SEC ID Nº 10) ;

(2) YLKNVQTQETRTLTQ (SEC ID Nº 13) ; o

(3) FYLKNVQTQETRTLTQFHF (SEC ID Nº 16) .

La invención también incluye un péptido aislado que se une a HLA-DR4, que consiste en la secuencia de aminoácidos:

(1) AYQAEPNTCATAQ (SEC ID Nº 17) ;

(2) LAKEWQALCAYQAEPNT (SEC ID Nº 19) ;

(3) AYQAEPNTCATAQGEGNIK (SEC ID Nº 20) ;

(4) WQALCAYQAEPNTCATAQ (SEC ID Nº 21) ; o

(5) LAKEWQALCAYQAEPNTCATAQGE (SEC ID Nº 22) .

La invención también incluye un péptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos KLKVESSPSRSDYINAS (SEC ID Nº 40) .

La invención también incluye un procedimiento de protección de un sujeto de la DMDI o los síntomas patogénicos de la DMDI. Se entiende que protección incluye el alivio (o disminución) , así como la eliminación de los síntomas patógenos en un sujeto. El procedimiento incluye la administración al sujeto de cualquiera de los péptidos anteriores de la invención por cualquiera de las vías divulgadas en el presente documento.

Otra realización de la invención es un procedimiento de diagnóstico de la DMDI que comprende: (a) proporcionar linfocitos CD4 de un individuo sospechoso de tener o de ser susceptible a la DMDI; (b) proporcionar una población de CPA que llevan en su superficie una molécula de MHC de clase II de un alelo idéntico a uno expresado por el individuo, habiendo estado en contacto la población de CPA con un péptido IA-2 y estando la molécula de MHC de

clase II de las CPA unida al péptido IA-2; (c) poner en contacto la población de las CPA de (b) con los linfocitos CD4 de (a) ; y (d) determinar si los linfocitos CD4 reconocen el péptido unido al MHC de clase, como indicación de que el individuo tiene o es susceptible a tener DMDI. El péptido IA-2 utilizado en el procedimiento tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: YLKNVQTQETRTL (SEC ID Nº 10) ; YLKNVQTQETRTLTQ (SEC ID Nº 13) ; FYLKNVQTQETRTLTQFHF (SEC ID Nº 16) ; AYQAEPNTCATAQ (SEC ID Nº 17) ; LAKEWQALCAYQAEPNT (SEC ID Nº 19) ; AYQAEPNTCATAQGEGNIK (SEC ID Nº 20) ; WQALCAYQAEPNTCATAQ (SEC ID Nº 21) ; LAKEWQALCAYQAEPNTCATAQGE (SEC ID Nº 22) ; y KLKVESSPSRSDYINAS (SEC ID Nº 40) .

Un péptido "aislado" de la invención es un péptido que, o bien no tiene homólogo de origen natural (por ejemplo, tal como un APL) o se ha separado o purificado a partir de componentes que lo acompañan de forma natural, por ejemplo, en tejidos tales como el páncreas, el hígado, el bazo, los ovarios, los testículos, el músculo, el tejido articular, el tejido nervioso, el tejido gastrointestinal o los fluidos corporales tales como sangre, suero, u orina. Típicamente, el péptido se considera "aislado" cuando carece de al menos 70 %, en peso seco, de las proteínas y moléculas orgánicas de origen natural con las que está asociado de forma natural. Preferentemente, una preparación de un péptido de la invención es al menos 80 %, más preferentemente al menos 90 %, y más preferentemente al menos 99 %, en peso seco, el péptido de la invención. Por tanto, por ejemplo, una preparación del péptido x es al menos 80 %, más preferentemente al menos 90 %, y más preferentemente al menos 99 %, en peso seco, el péptido x. Dado que un péptido que se sintetiza químicamente está, por su naturaleza, separado de los componentes que lo acompañan de forma natural, el péptido sintético está "aislado".

Un péptido aislado de la invención puede obtenerse, por ejemplo, mediante extracción de una fuente natural (por ejemplo, a partir de tejidos humanos o fluidos corporales) ; mediante expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica el péptido; o mediante síntesis química. Un péptido que se produce en un sistema celular diferente de la fuente de la que procede de forma está "aislado", ya que estará separado de los componentes que lo acompañan de forma natural. El grado de aislamiento o pureza puede medirse mediante cualquier procedimiento apropiado, por ejemplo, cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o análisis de HPLC.

Como se usa en el presente documento, "protección contra una enfermedad de mamífero" significa la prevención de la aparición de una enfermedad de mamífero o disminución de la gravedad de una enfermedad existente en un mamífero. "Prevención" puede incluir un retraso de la aparición, así como un bloqueo parcial o completo en el progreso de la enfermedad.

Como se usa en el presente documento, "un fragmento peptídico procesado de forma natural asociado a la diabetes" es un fragmento peptídico producido por la degradación proteolítica de una proteína (por ejemplo, insulina, proinsulina, preproinsulina, IA-2, IA-2ß, o GAD65) en una célula presentadora de antígeno de un mamífero. El reconocimiento de dicho péptido por los linfocitos T CD4 de un mamífero (por ejemplo, un paciente humano) es indicativo de la existencia, o de la futura aparición, de la diabetes en el mamífero.

A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que un experto en la técnica a la que esta invención pertenece entiende habitualmente. En caso de conflicto, el presente documento, incluidas las definiciones, tendrá prioridad. A continuación se describen procedimientos y materiales preferidos, aunque en la práctica o análisis de la presente invención se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la el presente documento. A menos que se indique lo contrario, estos materiales y procedimientos son únicamente ilustrativos y no están destinados a ser limitantes. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en el presente documento son sólo ilustrativas y no pretenden ser limitantes.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción, de las figuras y de las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 es un histograma que muestra los perfiles de citometría de flujo activada por fluorescencia de... [Seguir leyendo]

1. Un péptido aislado que se une a HLA-DR4, que consiste en la secuencia de aminoácidos:

(1) YLKNVQTQETRTL (SEC ID Nº 10) ;

(2) YLKNVQTQETRTLTQ (SEC ID Nº 13) ; o 5 (3) FYLKNVQTQETRTLTQFHF (SEC ID Nº 16) .

2. El péptido aislado de la reivindicación 1, que consiste en la secuencia de aminoácidos YLKNVQTQETRTL (SEC ID Nº 10) .

3. El péptido aislado de la reivindicación 1, que consiste en la secuencia de aminoácidos YLKNVQTQETRTLTQ 10 (SEC ID Nº 13) .

4. El péptido aislado de la reivindicación 1, que consiste en la secuencia de aminoácidos FYLKNVQTQETRTLTQFHF (SEC ID Nº 16) .

5. Un péptido aislado que se une a HLA-DR4, que consiste en la secuencia de aminoácidos:

(1) AYQAEPNTCATAQ (SEC ID Nº 17) ; 15 (2) LAKEWQALCAYQAEPNT (SEC ID Nº 19) ;

(3) AYQAEPNTCATAQGEGNIK (SEC ID Nº 20) ;

(4) WQALCAYQAEPNTCATAQ (SEC ID Nº 21) ; o

(5) LAKEWQALCAYQAEPNTCATAQGE (SEC ID Nº 22) .

6. El péptido aislado de la reivindicación 5, que consiste en la secuencia de aminoácidos AYQAEPNTCATAQ (SEC ID Nº 17) .

7. El péptido aislado de la reivindicación 5, que consiste en la secuencia de aminoácidos LAKEWQALCAYQAEPNT (SEC ID Nº 19) .

8. El péptido aislado de la reivindicación 5, que consiste en la secuencia de aminoácidos AYQAEPNTCATAQGEGNIK (SEC ID Nº 20) .

9. El péptido aislado de la reivindicación 5, que consiste en la secuencia de aminoácidos WQALCAYQAEPNTCATAQ (SEC ID Nº 21) .

10. El péptido aislado de la reivindicación 5, que consiste en la secuencia de aminoácidos 30 LAKEWQALCAYQAEPNTCATAQGE (SEC ID Nº 22) .

11. Un péptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos KLKVESSPSRSDYINAS (SEC ID Nº 40) .

12. Un procedimiento de diagnóstico de la diabetes mellitus dependiente de insulina (DMDI) que comprende:

(a) proporcionar linfocitos CD4 de un individuo sospechoso de tener, o que es susceptibles a tener, DMDI;

(b) proporcionar una población de CPA que llevan en su superficie una molécula del MHC de clase II de un

alelo idéntico a uno expresado por dicho individuo, habiéndose puesto en contacto la población de APC con un péptido IA-2 y estando la molécula del MHC de clase II unida al péptido IA-2;

(c) poner en contacto la población de CPA de (b) con los linfocitos CD4 de (a) ; y

(d) determinar si los linfocitos CD4 reconocen el péptido unido al MHC de clase II, como una indicación de que el individuo tiene, o es susceptible de tener, DMDI,

en el que dicho péptido IA-2 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

YLKNVQTQETRTL (SEC ID Nº 10) ; YLKNVQTQETRTLTQ (SEC ID Nº 13) ; FYLKNVQTQETRTLTQFHF (SEC ID Nº 16) ; AYQAEPNTCATAQ (SEC ID Nº 17) ; LAKEWQALCAYQAEPNT (SEC ID Nº 19) ; 45 AYQAEPNTCATAQGEGNIK (SEC ID Nº 20) ; WQALCAYQAEPNTCATAQ (SEC ID Nº 21) ; LAKEWQALCAYQAEPNTCATAQGE (SEC ID Nº 22) ; y KLKVESSPSRSDYINAS (SEC ID Nº 40) .

13. El aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en la protección de un sujeto frente a la diabetes mellitus dependiente de insulina (DMDI) o a los síntomas patogénicos de la DMDI.