Genes reguladores de la angiogénesis, preparaciones farmacéuticas que los contienen y sus aplicaciones.

Una composición farmacéutica que comprende como agente activo al menos una sustancia seleccionada entre:

(i) una molécula de ácido nucleico de un gen de una célula endotelial, de secuencia identificada con el número SEQ ID N º 1, SEQ ID N º 27 o SEQ ID N º 28 en la lista de secuencias adjunta,

(ii) una molécula polipeptídica codificada por dicha molécula de ácido nucleico identificada con el número SEQ ID Nº 6, SEQ ID Nº 31 o SEQ ID Nº 32 en la lista de secuencias adjunta,

para el diagnóstico in vivo, el pronóstico in vivo y/o el tratamiento de una patología angiogénica.

Genes reguladores de la angiogénesis, preparaciones farmacéuticas que los contienen y sus aplicaciones La presente invención pertenece al dominio de las composiciones farmacéuticas útiles para el tratamiento de patologías que resultan de una desregulación del mecanismo de la angiogénesis.

Se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden por una parte secuencias de nuevos genes, cuya función no ha sido identificada hasta la fecha y cuya implicación en el mecanismo de la angiogénesis ha sido demostrada por primera vez por el solicitante y por otra parte secuencias de genes, de los cuales al menos una de sus funciones ha sido identificada previamente, pero cuya implicación como genes que codifican los constituyentes celulares de la célula endotelial en el mecanismo de la angiogénesis, ha sido demostrada por primera vez en los trabajos realizados por el solicitante en el marco de la presente invención. Estos genes se identifican por sus secuencias nucleotídicas en la lista de secuencias adjunta. La presente invención se refiere también a las secuencias polipeptídicas de los factores codificados por dichos genes que encuentran aplicación en el estudio clínico del proceso de la angiogénesis, en el pronóstico, diagnóstico y tratamiento de patologías ligadas a este proceso, así como en la realización de ensayos farmacológicos, farmacogenómicos, o farmacosignalíticos.

La angiogénesis es un proceso fundamental por el cual se forman nuevos vasos sanguíneos. Este proceso es esencial en varios fenómenos fisiológicos normales tales como la reproducción, el desarrollo o incluso la cicatrización. En estos fenómenos biológicos normales, la angiogénesis está bajo estricto control, es decir, que se desencadena durante un breve período, algunos días, y después se inhibe completamente. Sin embargo, diversas patologías están relacionadas con una angiogénesis invasiva e incontrolada. La artritis, por ejemplo, es una patología debida al daño causado a los cartílagos por los neovasos invasivos. En la retinopatía diabética, la invasión de la retina por los neovasos lleva a la ceguera de los enfermos; la neovascularización del aparato ocular es la principal causa de ceguera y esta neovascularización es predominante en una veintena de enfermedades oculares. Por último, el crecimiento y la metástasis de los tumores están directamente relacionados con la neovascularización y son dependientes de la angiogénesis. El tumor estimula el crecimiento de los nuevos vasos sanguíneos para su propio crecimiento. Además, estos neovasos son las vías de escape de los tumores para alcanzar el sistema circulatorio sanguíneo y provocar las metástasis en sitios remotos tales como el hígado, el pulmón o los huesos.

En otras patologías tales como las enfermedades cardiovasculares, las enfermedades de las arterias periféricas y las lesiones vasculares o cerebrales, la angiogénesis puede presentar una base terapéutica importante. En efecto, la promoción de la angiogénesis en las áreas dañadas puede llevar a la formación de nuevos vasos sanguíneos laterales y alternativos a los vasos dañados, suministrando de este modo la sangre y por lo tanto el oxígeno y otros factores nutrientes y biológicos necesarios para la supervivencia de los tejidos afectados.

La formación de nuevos vasos sanguíneos por las células endoteliales implica la migración, el crecimiento, y la diferenciación de las células endoteliales. La regulación de estos fenómenos biológicos está directamente relacionada con la expresión genética. En términos de angiogénesis, un número creciente de estudios demuestran que la regulación de la angiogénesis se realiza a través de un equilibrio entre los factores que actúan directamente sobre las células endoteliales. Estos factores pueden ser estimulantes, por una parte, tales como, entre otros, el VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) , el FGF (factor de crecimiento de fibroblastos) , la IL-8 (interleucina 8) , el HGF/SF (factor de crecimiento de hepatocitos/factor disperso) , el PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas) . Los factores también pueden ser inhibidores, tales como, entre otros, IL-10, IL-12, gro-α y gro-β, el factor plaquetario 4, la angiostatina, el inhibidor derivado de condrocitos humanos, la trombospondina, el factor inhibidor de la leucemia. (Jensen, 1998, Surg. Neural., 49, 189-195; Tamatani et al., 1999, Carcinogenesis, 20, 957-962; Tanaka et al., 1998, Cancer Res., 58, 3362-3369; Ghe et al., 1997, Cancer Res., 57, 3733-3740; Kawahara et al., 1998, Hepatology, 28, 1512-1517; Chandhuni et al., 1997, Cancer Res., 57, 1814-1819; Jendraschak and Sage, 1996, Semin. Cancer Biol., 7, 139-146; Majewski et al., 1996, J. Invest. Dermatol., 106, 1114-1119) .

La regulación de la angiogénesis tal como se describe actualmente se realiza a través de un equilibrio de dos tipos de factores:

-los factores angiogénicos (polipéptidos extracelulares, en su mayoría mitógenos) que actúan directamente sobre las células endoteliales induciendo la angiogénesis.

-los factores angiostáticos (polipéptidos extracelulares, también en su mayoría mitógenos o que actúan sobre la mitogénesis) que actúan también directamente sobre las células endoteliales para inhibir la angiogénesis.

El equilibrio entre estos dos tipos de factores extracelulares regula la angiogénesis. Se observa en este punto, que el control de la angiogénesis se realiza por la producción de factores angiogénicos y factores angiostáticos. Por ejemplo, ya se ha demostrado que la estimulación de las células endoteliales por un factor angiogénico induce la expresión 1) del activador del plasminógeno tipo urocinasa (uPA) y de su inhibidor PAI-I (Pepper et al., 1990, J. Cell Biol. 111 (2) , 743-55; Pepper et al., 1996, Enzyme Protein, 49 (1-3) , 138-62) , 2) de las metaloproteinasas de la matriz (las MMP) y de inhibidores fisiológicos de la actividad de estas MMP (TIMPs) (Cornelius et al., 1995, J. Invest. Dermatol., 105 (2) , 170-6; Jackson and Nguyen, 1997, Int. J. Biochem. Cell Biol. 29 (10) , 1167-1177) , 3) de los

inhibidores tales como la angiopoyetina-2 (Ang-2) o la trombospondina-1 (TSP-1) (Mandriota and Pepper, 1998, Circ. Res. 83, 852-859; Oh et al., 1999, J. Biol. Chem., 274 (22) , 15732-9; Suzuma et al., 1999, American Journal of Pathology, 154, 343-354) . Por lo tanto, parece que normalmente una célula endotelial en el estado angiogénico produce factores angiogénicos, pero también factores angiostáticos. La producción de estos últimos permite controlar la angiogénesis.

En paralelo a esta operación, las células endoteliales estimuladas por un factor angiostático producen factores angiostáticos pero también factores angiogénicos para controlar el estado angiostático. Este fenómeno ha sido ya descrito en otros tipos de células productoras de factores implicados en la angiogénesis, que cuando son estimuladas por un factor angiostático tal como el interferón-gamma producen factores angiogénicos y factores angiostáticos (Kobayashi et al, 1995, Immunopharmacology 31 (1) , 93-101; Arkins et al., 1995, Mol. Endocrinol., 9 (3) , 350-60; Kodelja et al., 1997, Immunobiology, 197 (5) , 478-93) .

En la presente invención, el solicitante ha demostrado que la estimulación de las células endoteliales por un factor angiostático lleva a la expresión de genes que codifican los constituyentes celulares implicados en la promoción de la angiogénesis.

Por lo tanto, la estimulación de las células endoteliales por un factor angiogénico o por un factor angiostático puede inducir tanto una como otra, la expresión de reguladores positivos y negativos de la angiogénesis.

El control de la angiogénesis representa por tanto un eje estratégico, a la vez que una investigación fundamental, con el fin de mejorar la comprensión de numerosos fenómenos patológicos asociados con la angiogénesis, es también una base para el desarrollo de nuevas terapias destinadas a tratar las patologías asociadas con la angiogénesis.

Con el fin de controlar la angiogénesis, varios grupos farmacéuticos han desarrollado estrategias terapéuticas basadas directamente en el uso de señales paracrinas, los factores estimuladores e inhibidores, como agentes para promover o inhibir la angiogénesis. Estas estrategias se basan esencialmente en el uso de estos factores bajo su forma polipeptídica como agentes estimuladores o inhibidores de la angiogénesis, o incluso más recientemente, bajo la forma de vectores de expresión que codifican los factores seleccionados.

Se ha desarrollado un procedimiento que permite la identificación de nuevos genes implicados en la regulación de la angiogénesis. Dicho procedimiento ha sido... [Seguir leyendo]

1. Una composición farmacéutica que comprende como agente activo al menos una sustancia seleccionada entre:

(i) una molécula de ácido nucleico de un gen de una célula endotelial, de secuencia identificada con el número SEQ ID N º 1, SEQ ID N º 27 o SEQ ID N º 28 en la lista de secuencias adjunta,

(ii) una molécula polipeptídica codificada por dicha molécula de ácido nucleico identificada con el número SEQ ID Nº 6, SEQ ID Nº 31 o SEQ ID Nº 32 en la lista de secuencias adjunta,

para el diagnóstico in vivo, el pronóstico in vivo y/o el tratamiento de una patología angiogénica.

2. Una composición que comprende como agente activo al menos una molécula seleccionada entre una molécula de ácidos nucleicos antisentido de al menos una molécula seleccionada entre las SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 27 y SEQ ID Nº 28 en la lista de secuencias adjunta, para el diagnóstico in vivo, el pronóstico in vivo y/o el tratamiento de una patología angiogénica.

3. La composición farmacéutica para el diagnóstico in vivo, el pronóstico in vivo y/o el tratamiento de una patología angiogénica según la reivindicación 2, en donde dicha patología angiogénica comprende la enfermedad vascular periférica, cicatrización y reparación de tejidos, osteoporosis, vascularización de tumores, retinopatías, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, ateroesclerosis, hiperestimulación ovárica, psoriasis, endometriosis asociada con neovascularización, reestenosis debida a la angioplastia con globo, hiperproducción tisular debida a cicatrización, hipertensión, inflamación vascular, la enfermedad y el fenómeno de Raynaud, aneurisma, reestenosis arterial, tromboflebitis, linfagitis, linfedema, isquemia, angina de pecho, infarto de miocardio, cardiopatía crónica, insuficiencias cardiacas tales como insuficiencia cardíaca congestiva, degeneración macular asociada a la edad.

4. Una composición para el diagnóstico in vivo, el pronóstico in vivo y/o el tratamiento de una patología angiogénica según la reivindicación 2 o 3, caracterizada porque comprende la molécula de ácidos nucleicos antisentido identificada con el número SEQ ID Nº 11 en la lista de secuencias adjunta.

5. Una molécula de ácidos nucleicos antisentido identificada con el número SEQ ID Nº 11 en la lista de secuencias adjunta o una molécula de ácidos nucleicos antisentido que tiene una identidad al menos del 85 %, preferiblemente al menos del 95 % con la secuencia identificada con el número SEQ ID Nº 11 en la lista de secuencias adjunta.

6. Un vector de expresión de mamífero que comprende al menos una secuencia antisentido definida en la reivindicación 5.

7. El vector según la reivindicación 6, caracterizado porque es el vector GS-V1, identificado por la SEQ ID Nº 15 en la lista de secuencias adjunta.

8. Un método de diagnóstico y/o de pronóstico de una patología angiogénica en un mamífero, particularmente en un ser humano, caracterizado porque se detecta in vitro en las células de dicho mamífero la sobreexpresión o la subexpresión de una o más secuencias nucleotídicas identificadas con los números SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 27 y SEQ ID Nº 28 en la lista de secuencias adjunta, o la sobreexpresión o la subexpresión de una o más secuencias polipeptídicas identificadas con los números SEQ ID Nº 6, SEQ ID Nº 31 y SEQ ID Nº 32 en la lista de secuencias adjunta,

en donde dicha patología angiogénica comprende la vascularización de tumores, retinopatías, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, ateroesclerosis, hiperestimulación ovárica, psoriasis, endometriosis asociada con neovascularización, reestenosis debida a la angioplastia con globo, hiperproducción tisular debida a cicatrización, enfermedad vascular periférica, hipertensión, inflamación vascular, la enfermedad y el fenómeno de Raynaud, aneurisma, reestenosis arterial, tromboflebitis, linfagitis, linfedema, cicatrización y reparación de tejidos, isquemia, angina de pecho, infarto de miocardio, cardiopatía crónica, insuficiencias cardiacas tales como insuficiencia cardíaca congestiva, degeneración macular asociada a la edad y osteoporosis.

9. El método según la reivindicación 8, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

- la detección de la expresión de una o más de dichas secuencias nucleotídicas SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 27 y SEQ ID Nº 28 o de una o más de dichas secuencias polipeptídicas SEQ ID Nº 6, SEQ ID Nº 31 y SEQ ID Nº 32 por una población celular de un mamífero,

- la detección de la expresión de una o más de estas mismas secuencias nucleotídicas o polipeptídicas por una población celular de referencia cuyo estado angiogénico es conocido,

- la identificación de las posibles diferencias del nivel de expresión de estas mismas secuencias por las dos poblaciones celulares.

10. El método de diagnóstico y/o de pronóstico según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, caracterizado porque la detección de la expresión de las secuencias se realiza después de haber puesto en contacto las células endoteliales con un fluido biológico obtenido de un paciente.

11. Un método de verificación de la eficacia terapéutica de un tratamiento angiogénico en un mamífero, particularmente en un ser humano, caracterizado porque comprende la identificación in vitro en una población celular de dicho mamífero de la sobreexpresión o de la subexpresión de al menos un gen implicado en un trastorno angiogénico identificado por una de las secuencias nucleotídicas identificadas con los números SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 27 y SEQ ID Nº 28 en la lista de secuencias adjunta.

12. El método de verificación de la eficacia terapéutica según la reivindicación 11, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

- la detección de la expresión de una o más de dichas secuencias nucleotídicas SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 27 y SEQ ID Nº 28 por una población celular aislada de un mamífero al que se administra una composición terapéutica destinada a tratar un trastorno angiogénico que comprende la vascularización de tumores, retinopatías, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, ateroesclerosis, hiperestimulación ovárica, psoriasis, endometriosis asociada con neovascularización, reestenosis debida a la angioplastia con globo, hiperproducción tisular debida a cicatrización, enfermedad vascular periférica, hipertensión, inflamación vascular, la enfermedad y el fenómeno de Raynaud, aneurisma, reestenosis arterial, tromboflebitis, linfagitis, linfedema, cicatrización y reparación de tejidos, isquemia, angina de pecho, infarto de miocardio, cardiopatía crónica, insuficiencias cardiacas tales como insuficiencia cardíaca congestiva, degeneración macular asociada a la edad y osteoporosis,

- la detección de la expresión de estas mismas secuencias nucleotídicas por una población celular de referencia cuyo estado angiogénico es conocido,

- la identificación de las posibles diferencias del nivel de expresión de estas mismas secuencias por las dos poblaciones celulares.

13. El método de verificación de la eficacia terapéutica según la reivindicación 12, caracterizado porque la detección de la expresión de una o más secuencias nucleotídicas se realiza sobre una población celular aislada de dicho mamífero.

14. El método de verificación según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque la detección de la expresión de las secuencias se realiza después de haber puesto en contacto las células endoteliales con un fluido biológico obtenido de un paciente.

15. Un método de cribado in vitro de compuestos útiles para el tratamiento de un trastorno angiogénico en un mamífero, especialmente un ser humano, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) la detección de la expresión de una o más de dichas secuencias nucleotídicas SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 27 y SEQ ID Nº 28 o de dichas secuencias polipeptídicas SEQ ID Nº 6, SEQ ID Nº 31 y SEQ ID Nº 32 por una población celular aislada de un mamífero puesta en contacto con un compuesto capaz de tener un efecto terapéutico sobre un trastorno angiogénico que comprende la vascularización de tumores, retinopatías, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, ateroesclerosis, hiperestimulación ovárica, psoriasis, endometriosis asociada con neovascularización, reestenosis debida a la angioplastia con globo, hiperproducción tisular debida a cicatrización, enfermedad vascular periférica, hipertensión, inflamación vascular, la enfermedad y el fenómeno de Raynaud, aneurisma, reestenosis arterial, tromboflebitis, linfagitis, linfedema, cicatrización y reparación de tejidos, isquemia, angina de pecho, infarto de miocardio, cardiopatía crónica, insuficiencias cardiacas tales como insuficiencia cardíaca congestiva, degeneración macular asociada a la edad y osteoporosis,

b) la detección de la expresión de estas mismas secuencias nucleotídicas o polipeptídicas por una población celular de referencia cuyo estado angiogénico es conocido,

c) la identificación de las posibles diferencias del nivel de expresión de estas mismas secuencias por las dos poblaciones celulares.

16. El método de cribado según la reivindicación 15, caracterizado porque la detección de la expresión de las secuencias se realiza después de haber puesto en contacto las células endoteliales con un fluido biológico obtenido de un paciente.

Figura 1

1E) Control