Nuevos anticuerpos anti-IGF-IR y sus aplicaciones.

Anticuerpo aislado, o uno de sus fragmentos funcionales, siendo dicho anticuerpo o dicho uno de sus fragmentosfuncionales capaz de unirse al receptor del factor humano de crecimiento I tipo insulina IGF-IR,

caracterizado porquecomprende una cadena pesada que comprende las tres CDR de secuencia SEC ID nº 8, 10 y 12, y una cadenaligera que comprende las tres CDR de secuencia SEC ID nº 2, 4 y 6; y en dichas CDR, un residuo leucina estásustituido por una valina o una isoleucina, o a la inversa, y/o un residuo de ácido aspártico está sustituido por unresiduo de ácido glutámico, o a la inversa, y/o un residuo glutamina está sustituido por un residuo asparagina o a lainversa, y/o un residuo de arginina está sustituido por un residuo lisina o a la inversa.

Nuevos anticuerpos anti-IGF-IR y sus aplicaciones.

La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos capaces de unirse específicamente al receptor humano del factor de crecimiento I de tipo insulina IGF-IR, y/o capaces de inhibir específicamente la actividad de tirosina quinasa de dicho receptor de IGF-IR, especialmente anticuerpos monoclonales murinos, quiméricos y humanizados, así como a las secuencias de aminoácidos y nucleicas que codifican estos anticuerpos. La invención comprende igualmente el uso de estos anticuerpos como un medicamento para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de cánceres que sobreexpresan el IGF-IR, o cualquier patología relacionada con la sobreexpresión de dicho receptor, así como a procedimientos o equipos para el diagnóstico de enfermedades relacionadas con la sobreexpresión del receptor IGF-IR.

El receptor del factor de crecimiento I de tipo insulina, denominado IGF-IR, es un receptor con actividad de tirosina quinasa que tiene 70% de homología con el receptor de insulina IR. El IGF-IR es una glucoproteína de peso molecular de aproximadamente 350.000. Es un receptor heterotetramérico del cual cada mitad - enlazada por puentes de disulfuro - comprende una subunidad α extracelular y una subunidad β transmembránica (véase la figura 1) . El IGF-IR se une al IGF I e IGF II con una afinidad muy alta (Kd # 1 nM) , pero es igualmente capaz de unirse a la insulina con una afinidad 100 a 1000 veces menor. A la inversa, el IR se une a la insulina con una afinidad muy alta, aunque los IGF se unen sólo al receptor de insulina con una afinidad 100 veces menor. El dominio de tirosina quinasa del IGF-IR y del IR tiene una homología de secuencia muy alta, mientras que las zonas de homología más débil se refieren respectivamente a la región rica en cisteína, situada en la subunidad α, y la parte C-terminal de la subunidad β. Las diferencias de secuencias observadas en la subunidad α se sitúan en la zona de unión de los ligandos, y están por lo tanto en el origen de las afinidades relativas del IGF-IR y del IR para los IGF y la insulina, respectivamente. Las diferencias en la parte C-terminal de la subunidad δ dan como resultado una divergencia en las vías de señalización de los dos receptores; mediando el IGF-IR efectos mitogénicos, de diferenciación y de antiapoptosis, mientras que la activación del IR implica principalmente efectos a nivel de las vías metabólicas (Baserga et al., Biochim. Biophys. Acta, 1332: F105-126, 1997; Baserga R., Exp. Cell. Res., 253: 1-6, 1999) .

Las proteínas de tirosina quinasas citoplásmicas son activadas mediante la unión del ligando al dominio extracelular del receptor. La activación de las quinasas, a su vez, implica la estimulación de diferentes sustratos intracelulares, incluyendo IRS-1, IRS-2, Shc y Grb 10 (Peruzzi F. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 125: 166-173, 1999) . Los dos sustratos principales del IGF-IR son IRS y Shc que median, mediante la activación de numerosos efectores en dirección 3’, la mayoría de los efectos de crecimiento y de diferenciación relacionados con la unión de los IGF a este receptor (figura 2) . La disponibilidad de sustratos puede determinar, en consecuencia, el efecto biológico final relacionado con la activación del IGF-IR. Cuando predomina IRS-1, las células tienden a proliferar y a transformarse. Cuando domina Shc, las células tienden a diferenciarse (Valentinis B. et al., J. Biol. Chem. 274: 12423-12430, 1999) . Parecer ser que la vía que interviene principalmente en los efectos de protección contra la apoptosis es la vía de fosfatidilinositol 3-quinasas (PI 3-quinasas) (Prisco M. et al., Horm. Metab. Res., 31: 80-89, 1999; Peruzzi F. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 125: 166-173, 1999) .

La función del sistema de IGF en carcinogénesis ha sido el tema de investigaciones intensas en los últimos diez años. Este interés siguió al descubrimiento del hecho de que, además de sus propiedades mitogénicas y antiapoptóticas, parece que se requiere el IGF-IR para el establecimiento y el mantenimiento de un fenotipo transformado. En efecto, se ha establecido bien que una sobreexpresión o una activación constitutiva del IGF-IR lleva, en una gran variedad de células, a un crecimiento de las células independientes del soporte en medios que carecen de suero de ternera fetal, y a la formación de tumores en ratones atímicos. Esta no es en sí misma una propiedad única, puesto que una gran variedad de productos de genes sobreexpresados puede transformar células, incluyendo un buen número de receptores de factores de crecimiento. Sin embargo, el descubrimiento crucial que ha demostrado claramente la importante función desempeñada por el IGF-IR en la transformación, ha sido la demostración de que las células R-, en las cuales el gen que codifica el IGF-IR ha sido desactivado, son totalmente refractarias a la transformación por diferentes agentes que son usualmente capaces de transformar las células, tales como la proteína E5 del virus del papiloma bovino, una sobreexpresión del EGFR o del PDGFR, el antígeno T de SV 40, ras activado, o la combinación de estos dos últimos factores (Sell C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90: 11217-11221, 1993; Sell C. et al., Mol. Cell. Biol., 14: 3604-3612, 1994; Morrione A. J., Virol., 69: 5300-5303, 1995; Coppola D. et al., Mol. Cell. Biol., 14: 4588-4595, 1994; DeAngelis T et al., J. Cell. Physiol., 164: 214-221, 1995) .

El IGF-IR se expresa en una gran variedad de tumores y de líneas tumorales, y los IGF amplifican el crecimiento del tumor vía su unión al IGF-IR. Otros argumentos a favor de la función del IGF-IR en carcinogénesis provienen de estudios que usan anticuerpos monoclonales murinos dirigidos contra el receptor, o el uso de dominantes negativos del IGF-IR. En efecto, los anticuerpos monoclonales murinos dirigidos contra el IGF-IR inhiben la proliferación de numerosas líneas celulares en cultivo, y el crecimiento de células tumorales in vivo (Arteaga C. et al., Cancer Res.,

49: 6237-6241, 1989; Li et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 196: 92-98, 1993; Zia F et al., J. Cell. Biol., 24: 269275, 1996; Scotlandi K et al., Cancer Res., 58: 4127-4131, 1998) . Se ha mostrado igualmente, en los trabajos de Jiang et al. (Oncogene, 18: 6071-6077, 1999) , que un dominante negativo del IGF-IR es capaz de inhibir la proliferación tumoral.

La presente invención tiene por objeto poder disponer de un anticuerpo monoclonal murino, preferentemente un anticuerpo quimerizado o humanizado, que reconocerá específicamente y con gran afinidad al IGF-IR. Este anticuerpo interactuará poco o nada con el receptor IR de insulina. Su unión será capaz de inhibir in vitro el crecimiento de tumores que expresan el IGF-IR, interactuando principalmente con las vías de transducción de señales activadas durante las interacciones IGF1/IGF-IR e IGF2/IGF-IR. Este anticuerpo será capaz de ser activo in vivo en todos los tipos de tumores que expresan el IGF-IR, incluyendo los tumores de mama y de próstata dependientes de estrógeno, que no es el caso para los anticuerpos monoclonales anti-IGF-IR (escritos como AcM o ACM) disponibles actualmente. En efecto, el αlR3, que hace referencia al dominio del IGF-IR, inhibe totalmente in vitro el crecimiento de tumores de mama dependiente de estrógeno (MCF-7) , pero carece de efecto sobre el modelo correspondiente in vivo (Arteaga C. et al., J. Clin. Invest. 84: 1418-1423, 1989) . Además, el fragmento scFv-Fc, derivado del anticuerpo monoclonal murino 1H7, es sólo débilmente activo en el tumor de mama MCF-7, y totalmente inactivo sobre un tumor de próstata independiente de andrógenos (Li S. L. et al., Cancer Immunol. Immunother., 49: 243-252, 2000) .

De manera sorprendente, se ha demostrado un anticuerpo quimérico (denominado C7C10) , y dos anticuerpos humanizados, denominados respectivamente forma humanizada 1 de h7C10 y forma humanizada 2 de h7C10, derivados del anticuerpo monoclonal murino 7C10, que reconoce el IGF-IR y que responde a todos los criterios enunciados aquí arriba, es decir, a un no reconocimiento del receptor de insulina, a un bloqueo in vitro de la proliferación inducida por IGF1 y/o IGF2, pero igualmente a la inhibición in vivo del crecimiento de diferentes tumores que expresan el IGF-IR, entre los cuales están un osteosarcoma y un tumor pulmonar de células no pequeñas, pero igualmente, y más particularmente, el tumor de mama MCF-7 dependiente de estrógeno, y un tumor de próstata DU145 independiente de andrógenos. Además, y de manera sorprendente, la intensidad de inhibición del crecimiento de tumores de las células MCF-7 in vivo por el anticuerpo 7C10 es comparable, incluso significativamente superior, a la observada con tamoxifeno, uno... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo aislado, o uno de sus fragmentos funcionales, siendo dicho anticuerpo o dicho uno de sus fragmentos funcionales capaz de unirse al receptor del factor humano de crecimiento I tipo insulina IGF-IR, caracterizado porque comprende una cadena pesada que comprende las tres CDR de secuencia SEC ID nº 8, 10 y 12, y una cadena ligera que comprende las tres CDR de secuencia SEC ID nº 2, 4 y 6; y en dichas CDR, un residuo leucina está sustituido por una valina o una isoleucina, o a la inversa, y/o un residuo de ácido aspártico está sustituido por un residuo de ácido glutámico, o a la inversa, y/o un residuo glutamina está sustituido por un residuo asparagina o a la inversa, y/o un residuo de arginina está sustituido por un residuo lisina o a la inversa.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho fragmento funcional se selecciona de entre los fragmentos Fv, Fab, (Fab’) 2, Fab’, scFv, scFv-Fc y los dianticuerpos.

3. Anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, según una de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende una cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 54, y porque comprende una cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 69, y en dichas secuencias de aminoácidos, un residuo leucina está sustituido por una valina o una isoleucina, o a la inversa, y/o un residuo de ácido aspártico está sustituido por un residuo de ácido glutámico, o a la inversa, y/o un residuo glutamina está sustituido por un residuo asparagina o a la inversa, y/o un residuo de arginina está sustituido por un residuo lisina o a la inversa.

4. Anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales, según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico y comprende además las regiones constantes de cadena ligera y de cadena pesada derivadas de un anticuerpo de una especie heteróloga al ratón.

5. Anticuerpo quimérico, o uno de sus fragmentos funcionales, según la reivindicación 4, caracterizado porque dicha especie heteróloga es el ser humano.

6. Anticuerpo quimérico, o uno de sus fragmentos funcionales, según la reivindicación 5, caracterizado porque las regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada derivadas de un anticuerpo humano son, respectivamente, la región kappa y gamma-1, gamma-2 o gamma-4, en las cuales los segmentos del esqueleto FR1 a FR4 de dicha cadena ligera y/o cadena pesada, derivan respectivamente de segmentos del esqueleto FR1 a FR4 de cadena ligera y/o cadena pesada de anticuerpos humanos.

7. Anticuerpo humanizado, o uno de sus fragmentos funcionales, según la reivindicación 5, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 61 o 65, y porque comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 75, 79 u 83, y en dichas secuencias de aminoácidos, un residuo leucina está sustituido por una valina o una isoleucina, o a la inversa, y/o un residuo de ácido aspártico está sustituido por un residuo de ácido glutámico, o a la inversa, y/o un residuo glutamina está sustituido por un residuo asparagina o a la inversa, y/o un residuo de arginina está sustituido por un residuo lisina o a la inversa.

8. Ácido nucleico aislado, caracterizado porque se selecciona entre los siguientes ácidos nucleicos:

a) un ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica un anticuerpo según una de las reivindicaciones 1 a 7; y; b) un ácido nucleico complementario de un ácido nucleico tal como se define en a) ;

9. Vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 8.

10. Célula hospedante que comprende un vector según la reivindicación 9.

11. Animal transgénico, excepto el ser humano, que comprende por lo menos una célula transformada por un vector según la reivindicación 10.

12. Procedimiento de producción de un anticuerpo, o de uno de sus fragmentos funcionales, según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) cultivar en un medio y condiciones de cultivo adecuados una célula según la reivindicación 10; y

b) recuperar dichos anticuerpos, o uno de sus fragmentos funcionales, así producidos a partir del medio de cultivo o de dichas células cultivadas.

13. Anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, susceptible de ser obtenido mediante un procedimiento según la reivindicación 12.

14. Anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, según una de las reivindicaciones 1 a 7 y 13, a título de

medicamento.

15. Composición que comprende, a título de principio activo, un compuesto que consiste en un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, según una de las reivindicaciones 1 a 7 y 13.

16. Composición según la reivindicación 15 o composición que comprende:

a) un anticuerpo aislado, o uno de sus fragmentos funcionales, siendo dicho anticuerpo o dicho uno de sus fragmentos capaz de unirse al receptor del factor humano de crecimiento I tipo insulina IGF-IR y que comprende una cadena pesada que comprende las tres CDR de secuencia SEC ID nº 8, 10 y 12, y una cadena ligera que comprende las tres CDR de secuencia SEC ID nº 2, 4 y 6; o b) un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, siendo dicho anticuerpo o dicho uno de sus fragmentos funcionales capaz de unirse al receptor del factor humano de crecimiento I tipo insulina IGF-IR y que comprende una cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 54, y una cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 69; o c) un anticuerpo tal como se define en a) o b) de naturaleza quimérica y que comprende además las regiones constantes de cadena ligera y de cadena pesada derivadas de un anticuerpo de una especie heteróloga al ratón o al ser humano; o d) un anticuerpo humanizado, o uno de sus fragmentos funcionales, comprendiendo dicho anticuerpo una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 61 o 65, y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 75, 79 u 83,

estando dicha composición caracterizada porque comprende un segundo compuesto seleccionado de entre los compuestos capaces de inhibir específicamente la fijación del EGF sobre el receptor del factor humano de crecimiento de la epidermis EGFR y/o capaz de inhibir específicamente la actividad tirosina quinasa de dicho receptor EGFR.

17. Composición según la reivindicación 16, caracterizada porque dicho segundo compuesto se selecciona de entre los anticuerpos anti-EGFR aislados, o sus fragmentos funcionales, capaces de inhibir por competición la fijación del EGF sobre el EGFR.

18. Composición según la reivindicación 17, caracterizada porque dicho anticuerpo anti-EGFR se selecciona de entre los anticuerpos monoclonales, quiméricos o humanizados, o sus fragmentos funcionales.

19. Composición según una de las reivindicaciones 17 o 18, caracterizada porque dichos fragmentos funcionales del anticuerpo anti-EGFR se seleccionan de entre los fragmentos Fv, Fab, (Fab’) 2, Fab’, scFv-Fc y los dianticuerpos, o cualquier fragmento cuya semivida habría aumentado como unos fragmentos pegilados.

20. Composición según una de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizada porque dicho anticuerpo anti-EGFR es el anticuerpo monoclonal de ratón 225, su derivado quimérico ratón-ser humano C225, o un anticuerpo humanizado derivado de este anticuerpo 225.

21. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, o composición que comprende:

a) un anticuerpo aislado, o uno de sus fragmentos funcionales, siendo dicho anticuerpo o dicho uno de sus fragmentos capaz de unirse al receptor del factor humano de crecimiento I tipo insulina IGF-IR y que comprende una cadena pesada que comprende las tres CDR de secuencia SEC ID nº 8, 10 y 12, y una cadena ligera que comprende las tres CDR de secuencia SEC ID nº 2, 4 y 6; o b) un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, siendo dicho anticuerpo o dicho uno de sus fragmentos funcionales capaz de unirse al receptor del factor humano de crecimiento I tipo insulina IGF-IR y que comprende una cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 54, y una cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 69; o c) un anticuerpo tal como se define en a) o b) de naturaleza quimérica y que comprende además las regiones constantes de cadena ligera y de cadena pesada derivadas de un anticuerpo de una especie heteróloga al ratón o al ser humano; o d) un anticuerpo humanizado, o uno de sus fragmentos funcionales, comprendiendo dicho anticuerpo una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 61 o 65, y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 75, 79 u 83,

caracterizada porque dicha composición comprende, además, como producto de combinación para una utilización simultánea, separada o espaciada en el tiempo, un agente citotóxico/citostático y/o un inhibidor de la actividad tirosina quinasa respectivamente de los receptores al IGF-I y/o al EGF.

22. Composición según la reivindicación 21, caracterizada porque dicho agente citotóxico/citostático se selecciona de entre los agentes que interactúan con el ADN, los antimetabolitos, los inhibidores de topoisomerasas I o II, o los agentes inhibidores o estabilizadores del huso o también cualquier agente susceptible de ser utilizado en quimioterapia.

23. Composición según la reivindicación 21 o 22, caracterizada porque dicho agente citotóxico/citostático está acoplado químicamente a por lo menos uno de los elementos de dicha composición para una utilización simultánea.

24. Composición según la reivindicación 21 o 23, caracterizada porque dicho agente citotóxico/citostático se selecciona de entre los agentes inhibidores o estabilizadores del huso, preferentemente la vinorelbina, la vinflunina o la vincristina.

25. Composición según una de las reivindicaciones 21 a 24, caracterizada porque dicho inhibidor de la actividad tirosina quinasa respectivamente de los receptores al IGF-I y/o al EGF se selecciona de entre el grupo constituido por unos agentes naturales derivados, unas dianilinoftalimidas, unas pirazolo- o pirrolo-piridopirimidinas o también unas quinazilinas.

26. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 25, o composición que comprende:

a) un anticuerpo aislado, o uno de sus fragmentos funcionales, siendo dicho anticuerpo o dicho uno de sus fragmentos capaz de unirse al receptor del factor humano de crecimiento I tipo insulina IGF-IR y que comprende una cadena pesada que comprende las tres CDR de secuencia SEC ID nº 8, 10 y 12, y una cadena ligera que comprende las tres CDR de secuencia SEC ID nº 2, 4 y 6; o b) un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, siendo dicho anticuerpo o dicho uno de sus fragmentos funcionales capaz de unirse al receptor del factor humano de crecimiento I tipo insulina IGF-IR y que comprende una cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 54, y una cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 69; o c) un anticuerpo tal como se define en a) o b) de naturaleza quimérica y que comprende además las regiones constantes de cadena ligera y de cadena pesada derivadas de un anticuerpo de una especie heteróloga al ratón o al ser humano; o d) un anticuerpo humanizado, o uno de sus fragmentos funcionales, comprendiendo dicho anticuerpo una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 61 o 65, y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 75, 79 u 83,

caracterizada porque dicha composición comprende, además, otro compuesto anticuerpo dirigido contra el dominio extracelular del receptor HER2/neu, como producto de combinación para una utilización simultánea, separada o espaciada en el tiempo destinada a la prevención y al tratamiento de cáncer.

27. Composición según la reivindicación 26, caracterizada porque dicho anticuerpo dirigido contra el dominio extramembranario del receptor HER2/neu es el Trastuzumab, o uno de sus fragmentos funcionales.

28. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 27, caracterizada porque uno, por lo menos, de dichos anticuerpos, o uno de sus fragmentos funcionales, está conjugado con una toxina celular y/o un radioelemento.

29. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 28, a tíulo de medicamento.

Utilización de una composición según una de las reivindicaciones 15 a 29, para la preparación de un medicamento destinado a la prevención y/o altratamiento de cáncer.

31. Utilización según la reivindicación 30, caracterizada porque dicho cáncer es un cáncer seleccionado de entre el cáncer de la próstata, de próstata andrógeno-independiente, los osteosarcomas, el cáncer de pulmón, el cáncer de mama, el cáncer de endometrio o el cáncer de colon.

32. Método de diagnóstico in vitro de enfermedades inducidas por una sobreexpresión o una subexpresión del receptor IGF-IR y/o EGFR a partir de una muestra biológica en la cual se sospecha la presencia anormal del receptor IGF-IR y/o EGFR, caracterizado porque se pone en contacto dicha muestra biológica con un anticuerpo según una de las reivindicaciones 1 a 7 y 13, pudiendo dicho anticuerpo estar, llegado el caso, marcado.

33. Kit o neceser para llevar a cabo un método de diagnóstico de enfermedades inducidas por una sobreexpresión o

una subexpresión del receptor IGF-IR, o para llevar a cabo un procedimiento para la detección y/o la cuantificación de una sobreexpresión o de una subexpresión del receptor IGF-IR en una muestra biológica, preferentemente una sobreexpresión de dicho receptor, caracterizado porque dicho kit o neceser comprende los siguientes elementos:

a) un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, según una de las reivindicaciones 1 a 7 y 13;

b) opcionalmente, los reactivos para la formación del medio favorable para la reacción inmunológica;

c) opcionalmente, los reactivos que permitan la demostración de los complejos de IGF-IR/anticuerpo producidos 10 mediante la reacción inmunológica.