Homólogos del factor de necrosis tumoral y ácidos nucleicos que los codifican.

Anticuerpo aislado que se une específicamente a un polipéptido DNA101848 que comprende los residuos deaminoácidos 1 a 297 de la SEQ ID NO:

6 y es capaz de inhibir la unión de EDA-A2 a dicho polipéptido DNA101848.

Homólogos del factor de necrosis tumoral y ácidos nucleicos que los codifican

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere en general a la identificación y aislamiento de nuevo ADN y a la producción recombinante de polipéptidos nuevos que tiene homología con receptores del factor de necrosis tumoral, designado aquí como polipéptidos "DNA98853" y polipéptidos "DNA101848".

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El control de la cantidad de células en los mamíferos se cree que está determinado, en parte, por un equilibrio entre la proliferación celular y la muerte celular. Una forma de muerte celular, a veces denominada muerte celular necrótica, se caracteriza habitualmente como una forma patológica de muerte celular resultante de algún trauma o daño celular. En cambio, existe otra forma “fisiológica” de muerte celular que normalmente procede de una manera ordenada o controlada. Esta forma ordenada o controlada de muerte celular se denomina a menudo como “apoptosis” [véase, por ejemplo, Barr et al., Bio/Technology, 12:487-493 (1994) ; Steller et al., Science, 267: 14451449 (1995) ]. La muerte celular apoptótica tiene lugar de forma natural en muchos procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo embrionario y la selección clonal en el sistema inmunitario [Itoh et al, , Cell, 66:233-243 (1991) ]. Los niveles bajos de muerte celular apoptótica se ha asociado con una variedad de condiciones patológicas, que incluyen cáncer, lupus e infección del virus del herpes [Thompson, Science, 267:1456-1462 (1995) ]. Los niveles altos de muerte celular apoptótica pueden estar asociados con una variedad de otras condiciones patológicas, que incluyen SIDA, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, retinitis pigmentosa, degeneración cerebelar, anemia aplásica, infarto de miocardio, apoplejía, lesión por reperfusión, enfermedad del hígado inducida por toxina (véase, Thompson, supra].

La muerte celular apoptótica habitualmente se acompaña de uno o más cambios morfológicos y bioquímicos característicos en células, tales como la condensación del citoplasma, pérdida de microvellosidades en la membrana plasmática, segmentación del núcleo, degradación del ADN cromosómico o pérdida de la función mitocondrial. Se cree que hay una variedad de señales extrínsecas e intrínsecas que desencadenan o inducen tales cambios celulares morfológicos y bioquímicos [Raff, Nature, 356: 397-400 (1992) ; Steller, supra; Sachs et al., Blood, 82: 15 (1993) ]. Por ejemplo, pueden ser desencadenados por estímulos hormonales, tales como hormonas glucocorticoides para timocitos inmaduros, así como la eliminación de determinados factores de crecimiento [Watanabe-Fukunaga et al., Nature, 356: 314-317 (1992) ]. Además, se ha descrito que algunos de oncogenes identificados tales como myc, rel y E1A, y de supresores tumorales, como p53, tienen un papel en la inducción de la apoptosis. Asimismo, se ha observado que algunos fármacos quimioterapéuticos y algunas formas de radiación tienen actividad inductora de apoptosis [Thompson, supra].

Diversas moléculas, tales como el factor de necrosis tumoral-alfa ("TNF-alfa") , el factor de necrosis tumoralbeta ("TNF-beta" o "linfotoxina-alfa") , la linfotoxina-beta ("LT-beta") , el ligando CD30, el ligando CD27, el ligando CD40, el ligando OX-40, el ligando 4-1BB, el ligando de Apo-1 (también denominado como ligando Fas o ligando CD95) , el ligando de Apo-2 (también denominado como TRAIL) , el ligando de Apo-3 (también denominado TWEAK) , EDA y EDA-A2 se han identificado como miembros de la familia de citoquinas del factor de necrosis tumoral ("TNF") (véase, por ejemplo, Gruss y Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995) ; Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996) ; Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995) ; Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993) ; Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992) , WO 97/01633 publicada el 16 de enero de 1997; WO 97/25428 publicada el 17 de julio de 1997; Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998) ; Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997) ; Bayes et al., Human Molecular Genetics, 7: 1661-1669 (1998) ; Kere et al., Nature Genetics, 13:409-416 (1996) ]. De entre estas moléculas, se ha descrito que TNF-alfa, TNF-beta, el ligando CD30, el ligando 4-1BB, el ligando Apo-1, el ligando Apo-2 (TRAIL) y el ligando Apo-3 (TWEAK) están implicadas en la muerte de la célula apoptótica. Se ha descrito que tanto TNF-a como TNF-º inducen la muerte apoptótica en células tumorales susceptibles [Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986) ; Dealtr y et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987) ]. Zheng et al. han descrito que TNF-a está implicado en la apoptosis después de la estimulación de células T positivas en CD8 [Zheng et al., Nature, 377:348-351 (1995) ]. Otros investigadores han descrito que el ligando CD30 puede estar implicado en la eliminación de células T autorreactivas en el timo [Amakawa et al., Cold Spring Harbor Laborator y Symposium on Programmed Cell Death, Resumen No. 10, (1995) ].

Las mutaciones en el receptor de ratón Fas/Apo-1 o en los genes del ligando (denominados lpr y gld, respectivamente) se han relacionado con algunos trastornos autoinmunitarios, lo que indica que el ligando Apo-1 puede desempeñar algún papel en la regulación de la deleción clonal de linfocitos autorreactivos en la periferia [Krammer et al., Curr. Op. Immunol., 6: 279-289 (1994) ; Nagata et al., Science, 267: 1.449-1.456 (1995) ]. También se ha descrito que el ligando Apo-1 induce la apoptosis posterior a la estimulación en linfocitos T CD4-positivos y en linfocitos B, y puede estar implicado en la eliminación de linfocitos activados cuando su función ya no es necesaria [Krammer et al., supra; Nagata et al., supra]. Se ha descrito que los anticuerpos monoclonales de ratón agonistas que se unen específicamente al receptor Apo-1 muestran actividad citotóxica que es comparable o similar a la del

TNF-α [Yonehara et al., J. Exp. Med., 169: 1.747-1.756 (1989) ].

Se cree que la inducción de varias respuestas celulares mediadas por tales citoquinas de la familia del TNF, se inicia a partir de su unión a receptores celulares específicos. Se identificaron dos receptores distintos del TNF de aproximadamente 55 kDa (TNFR1) y 75 kDa (TNFR2) (Hohman et al., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989) ; Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990) ; EP 417.563, publicada el 20 de marzo de 1991) y se han aislado y caracterizado los ADNc de ser humano y ratón correspondientes a ambos tipos de receptores (Loetscher et al., Cell, 61:351 (1990) ; Schall et al., Cell, 61:361 (1990) ; Smith et al., Science, 248:1019-1023 (1990) ; Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991) ; Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991) ) . Se han asociado amplios polimorfismos con los genes de ambos receptores de TNF (véase, por ejemplo, (Takao et al., Immunogenetics, 37:199-203 (1993) ) . Ambos TNFR comparten la típica estructura de receptores de la superficie celular que incluyen regiones extracelular, transmembrana e intracelular. Las partes extracelulares de ambos receptores se hallan de forma natural también como proteínas de unión a TNF solubles (Nophar, Y. et al., EMBO J., 9:3269 (1990) ; y Kohno, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:8331 (1990) ) . La clonación de receptores de TNF solubles recombinantes se describen en Hale et al., J. Cell. Biochem. Suplemento 15F, 1991, p. 113 (P424) .

La parte extracelular de TNFR de tipo 1 y tipo 2 (TNFR1 y TNFR2) contiene un patrón de secuencia de aminoácidos repetitivo de cuatro dominios ricos de cisteína (CRD) designados 1 a 4, empezando desde el extremo terminal NH2. Cada CRD tiene aproximadamente 40 aminoácidos de largo y contiene 4 a 6 residuos de cisteína en las posiciones que están bien conservadas [Schall et al., supra; Loetscher et al., supra; Smith et al., supra; Nophar et al., supra; Kohno et al., supra]. En TNFR1, los límites aproximados de los cuatro CRD son los siguientes: CRD1 aminoácidos 14 a aproximadamente 53; CRD2 aminoácidos de aproximadamente 54 a aproximadamente 97; CDR3 aminoácidos de aproximadamente 98 a aproximadamente 138; CDR4 aminoácidos de aproximadamente 139 a aproximadamente 167. En TNFR2, CRD2 incluye aminoácidos 17 a aproximadamente 54; CDR2 aminoácidos de aproximadamente 55 a aproximadamente 97; CDR3 aminoácidos de aproximadamente 98 a aproximadamente 140; y CRD4 aminoácidos de aproximadamente 141 a aproximadamente 179 [Banner et al., Cell, 73:431-435 (1993) ]. El papel potencial de los CRD en la unión a ligando también se describe en Banner et al., supra.

Un patrón repetitivo similar de CRD existe en varias... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo aislado que se une específicamente a un polipéptido DNA101848 que comprende los residuos de aminoácidos 1 a 297 de la SEQ ID NO: 6 y es capaz de inhibir la unión de EDA-A2 a dicho polipéptido DNA101848. 5

2. Anticuerpo, según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

3. Anticuerpo, según la reivindicación 1 ó 2, en el que el anticuerpo está humanizado.

4. Anticuerpo, según la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en el que el anticuerpo es capaz de inhibir una actividad biológica de EDA-A2 que es la activación de NF-KB.

5. Anticuerpo, según la reivindicación 2 o la reivindicación 3, que es capaz de inhibir la unión de EDA-A2 a dicho polipéptido DNA101848 en por lo menos un 50%, en comparación con una molécula de control negativa. 15

6. Anticuerpo, según la reivindicación 5, que es capaz de inhibir la unión de EDA-A2 a dicho polipéptido DNA101848 en por lo menos un 90%, en comparación con una molécula de control negativa.

7. Composición que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y, opcionalmente, que 20 comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.

8. Método in vitro de inhibición de la actividad biológica del polipéptido EDA-A2 que es la activación de NF-KB en células de mamífero, que comprende exponer dichas células de mamífero a un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

9. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para utilizar en un método de inhibición de la actividad biológica del polipéptido EDA-A2 que es la activación de NF-KB en células de mamífero.

10. Anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para utilizar en un método de tratamiento de una 30 enfermedad relacionada con el sistema inmunitario o el cáncer en un mamífero.

11. Utilización de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario o el cáncer en un mamífero.