Agentes de unión específicos de angiopoyetina-2.

Un anticuerpo aislado que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera,

en el que:

(a) dicha región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 que tiene no más de cinco sustituciones de aminoácidos y dicha región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 que tiene no más de dos sustituciones de aminoácidos;

(b) dicha región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 que tiene no más de cinco sustituciones de aminoácidos y dicha región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 que tiene no más de dos sustituciones de aminoácidos; o

(c) dicha región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 que tiene no más de cinco sustituciones de aminoácidos y dicha región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 que tiene no más de dos sustituciones de aminoácidos;

y en el que el anticuerpo se une a e inhibe angiopoyetina-2 (Ang-2).

Agentes de unión específicos de angiopoyetina-2.

Campo de la invención La presente invención se refiere a agentes de unión específicos que reconocen y se unen a angiopoyetina-2 (Ang-2) . Más específicamente, la invención se refiere a la producción, uso diagnóstico y uso terapéutico de anticuerpos monoclonales y policlonales, y fragmentos de los mismos, que específicamente se unen a Ang-2.

Antecedentes de la invención La angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los existentes, es esencial para muchos procesos fisiológicos y patológicos. Normalmente, la angiogénesis está estrechamente regulada por factores pro y antiangiogénicos, pero en el caso de enfermedades tales como cáncer, enfermedades neovasculares oculares, artritis y psoriasis, el proceso puede fracasar. Folkman, J., Nat. Med., 1: 27-31 (1995) .

Existen numerosas enfermedades que se sabe que están asociadas a angiogénesis no regulada o no deseada. Tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, neovascularización ocular, tales como retinopatías (incluyendo retinopatía diabética) , degeneración macular relacionada con la edad, psoriasis, hemangioblastoma, hemangioma, arteriosclerosis, enfermedad inflamatoria, tal como enfermedad inflamatoria reumatoide o reumática, especialmente artritis (incluyendo artritis reumatoide) , u otros trastornos inflamatorios crónicos, tales como asma crónica, aterosclerosis arterial o posterior a trasplante, endometriosis y enfermedades neoplásicas, por ejemplo los denominados tumores sólidos y tumores líquidos (o hematopoyéticos) (tales como leucemias y linfomas) . Otras enfermedades asociadas a angiogénesis no deseada resultarán evidentes para los expertos en la técnica.

Aunque se ha implicado a muchos sistemas de transducción de señales en la regulación de la angiogénesis, uno de los sistemas mejor caracterizado y más selectivo de células endoteliales implica el receptor tirosina quinasa Tie-2 (denominado “Tie-2” o “Tie-2R” (además denominado “ORK”) ; Tie-2 murino también se denomina “tek”) y sus ligandos, las angiopoyetinas (Gale, N. W. y Yancopoulos, G. D., Genes Dev. 13: 1055-1066 [1999]) . Existen 4 angiopoyetinas conocidas; angiopoyetina-1 (“Ang-1”) hasta angiopoyetina-4 (“Ang-4”) . Estas angiopoyetinas también se denominan “ligandos de Tie-2”. (Davis, S., et al., Cell, 87: 1161-1169 [1996]; Grosios, K., et al., Cytogenet Cell Genet, 84: 118-120 [1999]; Holash, J., et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42: 1617-1625 [1999]; Koblizek, T. I., et al., Actual Biology, 8: 529-532 [1998]; Lin, P., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 95: 8829-8834 [1998]; Maisonpierre, P. C., et al., Science, 277: 55-60 [1997]; Papapetropoulos, A., et al., Lab Invest, 79: 213-223 [1999]; Sato, T. N., et al., Nature, 375: 70-74 [1998]; Shyu, K. G., et al., Circulation, 98: 2081-2087 [1998]; Suri, C., et al., Cell, 87: 1171-1180 [1996]; Suri, C., et al., Science, 282: 468-471 [1998]; Valenzuela, D. M., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 96: 1904-1909 [1999]; Witzenbichler, B., et al., J Biol Chem, 273: 18514-18521 [1998]) . Mientras que Ang-1 al unirse a Tie-2 estimula la fosforilación de receptores en células endoteliales cultivadas, se ha observado que Ang-2 tanto agoniza como antagoniza la fosforilación del receptor Tie-2 (Davis, S., et al., [1996], citado anteriormente; Maisonpierre, P. C., et al., [1997], citado anteriormente; Kim, I., J. H. Kim, et al., Oncogene 19 (39) : 4549-4552 (2000) ; Teichert-Kuliszewska, K., P. C. Maisonpierre, et al., Cardiovascular Research 49 (3) : 659-70 (2001) ) .

Los fenotipos de ratón inactivado (knockout) para Tie-2 y Ang-1 son similares y sugieren que la fosforilación de Tie-2 estimulada por Ang-1 media la remodelación y estabilización de vasos en desarrollo en el útero a través del mantenimiento de la adhesión de células de soporte de células endoteliales (Dumont, D. J., et al., Genes & Development, 8: 1897-1909 [1994]; Sato, T. N., et al., Nature, 376: 70-74 [1995]; Suri, C., et al., [1996], citado anteriormente) . El papel de Ang-1 en la estabilización de los vasos se cree que se conserva en el adulto, donde se expresa de manera amplia y constitutiva (Hanahan, D., Science, 277: 48-50 [1997]; Zagzag, D., et al., Experimental Neurology, 159: 391-400 [1999]) . Por el contrario, la expresión de Ang-2 se limita principalmente a sitios de remodelación vascular, donde se cree que bloquea la función de Ang-1, induciendo de ese modo un estado de plasticidad vascular que conduce a angiogénesis (Hanahan, D., [1997], citado anteriormente; Holash, J., et al., Science, 284: 1994-1998 [1999]; Maisonpierre, P. C., et al., [1997], citado anteriormente) .

Numerosos estudios publicados han demostrado supuestamente la expresión de Ang-2 selectiva de vasos en estados patológicos asociados a angiogénesis. Estos estados patológicos incluyen, por ejemplo, psoriasis, degeneración macular y cáncer (Bunone, G., et al., American Journal of Pathology, 155: 1967-1976 [1999]; Etoh, T., et al., Cancer Research, 61: 2145-2153 [2001]; Hangai, M., et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42: 1617-1625 [2001]; Holash, J., et al., [1999] citado anteriormente; Kuroda, K., et al., Journal of Investigative Dermatology, 116: 713-720 [2001]; Otani, A., et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 40: 1912-1920 [1999]; Stratmann, A., et al., American Journal of Pathology, 153: 1459-1466 [1998]; Tanaka, S., et al., J Clin Invest,

103: 34-345 [1999]; Yoshida, Y., et al., International Journal of Oncology, 15: 1221-1225 [1999]; Yuan, K., et al., Journal of Periodontal Research, 35: 165-171 [2000]; Zagzag, D., et al., [1999] citado anteriormente) . La mayoría de estos estudios se han centrado en el cáncer, en el que muchos tipos de tumores parecen presentar expresión de Ang-2 vascular. En contraposición a su expresión en angiogénesis patológica, la expresión de Ang-2 en tejidos normales es extremadamente limitada (Maisonpierre, P. C., et al., [1997], citado anteriormente; Mezquita, J., et al.,

Biochemical and Biophysical Research Communications, 260: 492-498 [1999]) . En el adulto normal, los tres sitios principales de angiogénesis son el ovario, la placenta y el útero; estos son los tejidos primarios en tejidos normales (es decir, no cancerosos) en los que se ha detectado ARNm de Ang-2.

Determinados estudios funcionales sugieren que Ang-2 puede estar implicada en la angiogénesis tumoral. Ahmad et al. (Cancer Res., 61: 1255-1259 [2001]) describen la sobreexpresión de Ang-2 y muestran que está supuestamente asociada a un aumento en el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de ratón. Véase también Etoh et al., citado anteriormente, y Tanaka et al., citado anteriormente, en los que se presentan datos que asocian supuestamente la sobreexpresión de Ang-2 con hipervascularidad tumoral. Sin embargo, por el contrario, Yu et al. (Am. J. Path., 158: 563-570 [2001]) notifican datos que muestran que la sobreexpresión de Ang-2 en células de carcinoma de pulmón de Lewis y carcinoma mamario TA3 prolongaba supuestamente la supervivencia de los ratones a los que se les inyectaron los transfectantes correspondientes.

En los últimos pocos años, diversas publicaciones han sugerido que Ang-1, Ang-2 y/o Tie-2 son una posible diana para terapia anticancerígena. Por ejemplo, las patentes estadounidenses nos. 6.166.185, 5.650.490 y 5.814.464 describen cada una el concepto de anticuerpos anti-ligando Tie-2 y cuerpos de receptor. Lin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci USA, 95: 8829-8834 [1998]) inyectaron un adenovirus que expresaba Tie-2 soluble en ratones; el Tie-2 soluble supuestamente disminuyó el número y tamaño de los tumores desarrollados por los ratones. En un estudio relacionado, Lin et al (J. Clin. Invest., 100: 2072-2078 [1997]) inyectaron una forma soluble de Tie-2 en ratas; este compuesto supuestamente redujo el tamaño tumoral en las ratas. Siemeister et al. (Cancer Res., 59: 3185-3189 [1999]) generaron líneas celulares de melanoma humano que expresaban el dominio extracelular de Tie-2, inyectaron estas líneas celulares en ratones desnudos y concluyeron que Tie-2 soluble daba como resultado supuestamente una “inhibición significativa” del crecimiento tumoral y la angiogénesis tumoral. En vista de esta información, y dado que tanto Ang-1 como Ang-2 se unen a Tie-2, no queda claro a partir de estos estudios si Ang-1, Ang-2 o Tie-2 serían dianas atractivas para terapia anticancerígena.

La fusión de determinados péptidos a una proteína plasmática estable tal como una región constante de Ig para mejorar la vida media de estas moléculas se ha descrito en, por ejemplo,... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo aislado que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en el que:

(a) dicha región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 que tiene no más de cinco sustituciones de aminoácidos y dicha región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 que tiene no más de dos sustituciones de aminoácidos;

(b) dicha región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 que tiene no más de cinco sustituciones de aminoácidos y dicha región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 que tiene no más de dos sustituciones de aminoácidos; o

(c) dicha región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 que tiene no más de cinco sustituciones de aminoácidos y dicha región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 que tiene no más de dos sustituciones de aminoácidos;

y en el que el anticuerpo se une a e inhibe angiopoyetina-2 (Ang-2) .

2. El anticuerpo aislado según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

3. El anticuerpo aislado según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicho anticuerpo es completamente humano.

4. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo aislado según la reivindicación 3 y un agente de formulación farmacéuticamente aceptable.

5. Una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

6. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5.

7. Una célula huésped aislada que contiene el vector según la reivindicación 6.

8. Un conjugado que comprende el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

9. Un método de preparación de un anticuerpo que comprende:

(a) transformar una célula huésped con al menos una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5;

(b) expresar la molécula de ácido nucleico en la célula huésped; y

(c) aislar el anticuerpo, en el que la célula huésped no es una célula humana.

10. Un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para su uso en la inhibición de la angiogénesis no deseada.

11. Un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para su uso en el tratamiento de cáncer.

12. Un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para su uso en la inhibición de la actividad de angiopoyetina-2.

13. Un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para su uso en el tratamiento de al menos una de enfermedad neovascular ocular, hemangioblastoma, hemangioma, enfermedad inflamatoria, trastornos inflamatorios crónicos, endometriosis, enfermedad neoplásica, enfermedad relacionada con los huesos o psoriasis.

14. Un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un agente quimioterápico para su uso en el tratamiento de cáncer.