LA INVENCION PROPORCIONA COMPOSICIONES Y METODOS RELACIONADOS CON UNA TRANSCRIPTASA REVERSA DE TELOMERASA HUMANA (HTRT),

LA SUBUNIDAD PROTEICA CATALITICA DE LA TELOMERASA HUMANA. LOS POLINUCLEOTIDOS Y POLIPEPTIDOS DE LA INVENCION SON UTILES PARA EL DIAGNOSTICO, PROGNOSIS Y TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES HUMANAS, PARA CAMBIAR LA CAPACIDAD PROLIFERATIVA DE CELULAS Y ORGANISMOS, Y PARA LA IDENTIFICACION Y ESCRUTINIO DE COMPUESTOS Y TRATAMIENTOS UTILES PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES TALES COMO EL CANCER.

Subunidad catalítica de la telomerasa humana.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos ácidos nucleicos que codifica la subunidad catalítica de telomerasa y polipéptidos relacionados. En particular, la presente invención está dirigida a la subunidad catalítica de telomerasa humana. La invención proporciona métodos y composiciones referentes a medicina, biología molecular, química, farmacología y diagnóstico médico y tecnología de prognosis.

Antecedentes de la invención

El objetivo de la siguiente exposición consiste en presentar el campo de la presente invención.

Durante mucho tiempo se ha reconocido que la réplica completa de los extremos terminales de cromosomas eucarióticos requiere componentes celulares especializados (Watson, 1972, Nature New Biol., 239:197; Olovnikov, 1973, J. Theor. Biol., 41:181) . La réplica de un filamento lineal de DNA por polimerasas de DNA convencionales requiere un ARN iniciador y puede proceder sólo 5' a 3'. Cuando el ARN enlazado en los extremos terminales de 5' de los filamentos de DNA cromosómicos eucarióticos es eliminado, se introduce un hueco, conduciendo a una reducción progresiva de filamentos hijos con cada ciclo de réplica. Se cree que esta reducción de telómeros, las estructuras de DNA de proteína físicamente situadas en los extremos de cromosomas, da razón del fenómeno de senectud o envejecimiento celular (vea, por ejemplo, Goldstein, 1990, Science 249:1129; Martin y otros, 1979, Lab. Invest. 23:86; Goldstein y otros, 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 64:155; y Schneider y Mitsui, 1976, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73:3584) de células somáticas humanas normales in vitro y in vivo.

Por lo tanto, la longitud e integridad de los telómeros se relaciona con la entrada de una célula a una etapa de senectud (es decir, pérdida de la capacidad de proliferación) . Además, la habilidad de una célula de mantener (o aumentar) la longitud de los telómeros puede permitir que una célula evite la senectud, es decir, se vuelva inmortal.

En muchos sistemas se ha investigado la estructura de los telómeros y DNA telomérico (vea, por ejemplo, Harley y Villeponteau, 1995, Curr. Opin. Genet. Dev. 5:249) . En la mayor parte de los organismos, el DNA telomérico consta de un arreglo tandémico de secuencias muy simples; en humanos y otros vertebrados, el DNA telomérico consta de cientos a miles de repeticiones en tándem de la secuencia TTAGGG. Los métodos para determinar y modular la longitud de los telómeros en las células se describen en las Publicaciones PCT WO 93/23572 y WO 96/41016.

El mantenimiento de los telómeros es una función de una polimerasa de DNA específica de los telómeros conocida como telomerasa. La telomerasa es una ribonucleoproteína (RNP) que usa una parte de su mitad de ARN como un molde para síntesis de DNA repetitivo de telómeros (Morin, 1997, Eur. J. Cancer 33:750; Yu y otros, 1990, Nature 344:126; Singer y Gottschling, 1994, Science 266:404; Autexier y Greider, 1994, Genes Develop., 8:563; Gilley y otros, 1995, Genes Develop., 9:2214; McEachern y Blackburn, 1995, Nature 367:403; Blackburn, 1992, Ann Rev. Biochem., 61:113; Greider, 1996, Ann. Rev. Biochem., 65:337) . Los componentes de ARN de humano y otras telomerasas han sido clonados y caracterizados (vea, Publicación PCT WO 96/01835 y Feng y otros, 1995, Science 269:1236) . Sin embargo, la caracterización de los componentes de la proteína de telomerasa ha sido difícil. En parte, esto es porque se ha comprobado que es difícil purificar la RNP de telomerasa, la cual está presente en niveles extremadamente bajos en las células en las cuales se expresa. Por ejemplo, se ha estimado que las células humanas conocidas para expresar niveles altos de actividad de telomerasa pueden tener sólo alrededor de cien moléculas de la enzima por célula.

Consistente con la relación de telómeros y telomerasa con la capacidad de proliferación de una célula (es decir, la habilidad de la célula de dividirse indefinidamente) , la actividad de telomerasa se detecta en líneas celulares inmortales y un conjunto extraordinariamente diverso de tejidos de tumor, pero no se detecta (es decir, estuvo ausente o abajo del umbral del ensayo) en cultivos de células somáticas normales o tejidos normales adyacentes a un tumor (vea, Patente de los Estados Unidos Números 5, 629, 154; 5, 489, 508; 5, 648, 215; y 5, 639, 613; vea también, Morin, 1989, Cell 59:521; Shay y Bacchetti 1997, Eur. J. Cancer 33:787; Kim y otros, 1994, Science 266:2011; Counter y otros, 1992, EMBO J. 11:1921; Counter y otros, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 2900; Counter y otros, 1994, J. Virol. 68:3410) . Además, se ha reportado una correlación entre el nivel de actividad de telomerasa en un tumor y el posible resultado clínico del paciente (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos Número 5, 639, 613, arriba; Langford y otros, 1997, Hum. Pathol. 28:416) . También se ha detectado actividad de telomerasa en células de gérmenes humanos, células impulsoras y progenitoras de proliferación y linfocitos activados. En células somáticas impulsoras y progenitoras y en linfocitos activados, la actividad de telomerasa en general es muy baja o sólo se expresa temporalmente (vea, Chiu y otros, 1996, Stem Cells 14:239; Bodnar y otros, 1996, Exp. Cell Res. 228:58; Taylor y otros, 1996, J. Invest. Dermatology 106:759) .

La telomerasa humana es un objetivo ideal para diagnosticar y tratar enfermedades humanas referentes a la proliferación y senectud, como el cáncer. Los métodos para diagnosticar y tratar cáncer y otras enfermedades relacionadas con la telomerasa en humanos se describen en la Patente de los Estados Unidos Números 5, 489, 508, 5, 639, 613 y 5, 645, 986. Los métodos para pronosticar el avance de tumores supervisando la telomerasa se describen en la Patente de los Estados Unidos Número 5, 639, 613. El descubrimiento y caracterización de la subunidad de proteína catalítica de telomerasa humana proporcionarían ensayos útiles adicionales para la telomerasa y para diagnóstico y terapia de enfermedades. Además, la clonación y determinación de la secuencia primaria de la subunidad de proteína catalítica permitirían terapias más eficaces para cánceres humanos y otras enfermedades relacionadas con la capacidad de proliferación y senectud de células.

Breve sumario de la invención

La presente invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica un polipéptido capaz de presentar una actividad telomerasa catalítica cuando está asociado con un ARN de telomerasa y que es:

(a) un polinucleótido que tiene la secuencia del injerto del plásmido ATCC 209016; o

(b) un polinucleótido que se hibrida a (a) bajo condiciones rigurosas; o

(c) un polinucleótido que se hibrida a NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA 3 ó NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA 8 bajo condiciones rigurosas; o

(d) una secuencia de polinucleótido que se degenera como consecuencia del código genético a las secuencias definidas en (a) o (b) .

En otro aspecto la invención proporciona una composición que comprende por lo menos 20% de proteína catalítica de telomerasa humana que tiene una secuencia codificada por un polinucleótido según la invención, presentando dicha composición una actividad de telomerasa catalítica solamente si un ARN de telomerasa está añadido a la composición a fin de asociarse con dicha proteína. Dichas proteínas capaces de presentar una actividad de telomerasa catalítica pueden, por ejemplo, estar caracterizadas porque tienen un motivo definido que presenta la secuencia de aminoácidos:

Trp-R1-X7-R1-R1-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8-9-R3-R3-Arg-R4-X2-Trp

donde X es cualquier aminoácido y un subíndice se refiere al número de residuos consecutivos, R1 es leucina o isoleucina, R2 es glutamina o arginina, R3 es fenilalanina o tirosina y R4 es lisina o histidina.

Asimismo, el ácido nucleico aislado, substancialmente puro o recombinante según la invención puede codificar una proteína comprendiendo una secuencia de aminoácidos:

Trp-R1-X7-R1-R1-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8-9-R3-R3-Arg-R4-X2-Trp

La invención abarca oligonucleótidos y polinucleótidos compartiendo identidad o complementariedad de secuencia substancial con una subsecuencia de dichos ácidos nucleicos.

Proteínas de transcriptasa inversa de telomerasa humana (hTRT) que pueden incluirse en las composiciones según la invención incluyen proteína de hTRT, o una variante de la misma, o un fragmento de... [Seguir leyendo]

1. Polinucleótido que comprende una secuencia que codifica un polipéptido capaz de presentar actividad catalítica de telomerasa cuando se asocia con una ARN telomerasa y que es:

(a) un polinucléotido que presenta la secuencia de la inserción del plásmido ATCC 209016; o

(b) un polinucleótido que se hibrida con (a) en condiciones restrictivas; o

(c) un polinucleótido que se hibrida con la SEC ID nº 3 ó con la SEC ID nº 8 en condiciones restrictivas; o

(d) una secuencia de polinucleótido que se degenera como resultado del código genético para las secuencias definidas en (a) o (b) .

2. Polinucleótido según la reivindicación 1, unido operativamente a un promotor.

3. Utilización de un polinucleótido según la reivindicación 1, en el análisis o la detección de una secuencia del gen hTHT o de hTHT RNA.

4. Utilización de un polinucleótido según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para la preparación de una célula huésped recombinante.

5. Vector que contiene un polinucleótido según la reivindicación 1.

6. Célula que contiene un vector según la reivindicación 5.

7. Utilización in vitro de un vector de expresión que contiene un polinucleótido según la reivindicación 1, en la expresión de un polipéptido capaz de presentar actividad catalítica de telomerasa cuando se asocia a una ARN telomerasa.

8.Composición que comprende por lo menos 20% de proteína catalítica de telomerasa humana que presenta una secuencia codificada por un polinucleótido según la reivindicación 1, presentando la composición únicamente actividad catalítica de telomerasa si se añade a la composición ARN telomerasa con el fin de asociarse con dicha proteína.

9. Utilización de una composición según la reivindicación 8, en la preparación de un complejo, acomplejando un componente del molde de ARN con dicha proteína.

10. Utilización de un polinucleótido según la reivindicación 1, en el aumento de la capacidad proliferante de una célula de vertebrado introduciendo in vitro dicho polinucleótido dentro de la célula.

11. Utilización de un polipéptido que se puede obtener por expresión de un vector según la reivindicación 5, en el aumento de la capacidad proliferante de una célula de vertebrado introduciendo in vitro dicho polipéptido en la célula.

12. Utilización de una composición según la reivindicación 8, en el aumento de la capacidad proliferante de una célula de vertebrado introduciendo dicha composición dentro de la célula in vitro.

13. Procedimiento para la preparación de una composición de telomerasa recombinante que comprende la expresión de un polinucleótido según la reivindicación 1, para producir un polipéptido, poner en contacto dicho polipéptido con un componente del molde de RNA, preferentemente un componente de ARN telomerasa humana, en condiciones tales que dicho polipéptido y dicha ARN telomerasa se asocian para formar una enzima de telomerasa capaz de catalizar la adición de nucleótidos a un sustrato de telomerasa.

14. Anticuerpo o su fragmento de unión que se une específicamente a una proteína capaz de presentar una actividad catalítica de la telomerasa si dicha proteína se asocia a una ARN telomerasa, presentando dicha proteína una secuencia codificada por un polinucleótido según la reivindicación 1, siendo opcionalmente monoclonal dicho anticuerpo o fragmento.

15. Hibridoma capaz de secretar un anticuerpo según la reivindicación 14.

16. Procedimiento para determinar si un compuesto, una composición o un tratamiento es un modulador de la actividad o de la expresión de la transcriptasa inversa de telomerasa, que comprende exponer in vitro una célula según la reivindicación 6 al compuesto, la composición o el tratamiento y determinar si existe un cambio en la actividad o la expresión de la transcriptasa inversa de telomerasa.

17. Procedimiento para proporcionar un producto farmacéutico, que comprende efectuar las etapas de un procedimiento según la reivindicación 16 y a continuación formular un modulador de la actividad de la transcriptasa inversa de telomerasa o de la expresión de hTRT, identificado por dicho método para la utilización farmacéutica para conseguir la modulación de la actividad de la transcriptasa inversa de telomerasa o de la expresión de hTRT.

18. Método para detectar en una muestra un producto génico de hTRT, su mutante o variante, que comprende poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo o fragmento de unión según la reivindicación 14 y determinar si se ha formado un complejo con un producto génico de hTRT, mutante o variante.

19. Método para detectar en una muestra un producto génico de hTRT, su mutante o variante, que comprende poner en contacto dicha muestra con un polinucleótido según la reivindicación 1 o un polinucleótido que comprende una secuencia de por lo menos 12 nucleótidos, opcionalmente por lo menos 15 nucleótidos, idéntica a, o exactamente complementaria a una secuencia contigua al polinucleótido del apartado (a) de la reivindicación 1 y determinar si se ha formado un complejo de hibridación.

20. Método para detectar en una muestra un producto génico de hTRT, su mutante o variante, que comprende utilizar un polinucleótido que comprende una secuencia de por lo menos 12 nucleótidos, opcionalmente por lo menos 15 nucleótidos, idéntica a, o exactamente complementaria a una secuencia contigua del polinucleótido del apartado

(a) de la reivindicación 1, en un procedimiento de amplificación y determinar si se ha formado un producto específico de la amplificación.

21. Método para la detección de la presencia de por lo menos una célula humana positiva a la telomerasa en una muestra biológica que comprende células humanas, que comprende:

(a) medir la cantidad de un producto génico de hTRT, de su mutante o variante en dicha muestra utilizando las etapas de un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20; y

(b) comparar la cantidad de dicho producto génico, de su mutante o variante así medida con una referencia que correlaciona con una muestra que carece de células positivas a telomerasa, en el que la presencia de una cantidad mayor del producto génico de hTRT, mutante o variante en dicha muestra comparada con dicha referencia correlaciona con la presencia de células positivas a telomerasa en dicha muestra biológica.

22. Método para el diagnóstico de un estado relacionado con la telomerasa, que comprende:

(a) determinar la cantidad de un producto génico de hTRT, mutante o variante en una muestra de célula o tejido de un paciente utilizando las etapas de un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20; y

(b) comparar la cantidad de dicho producto génico, mutante o variante en la muestra con la cantidad en una célula o tejido sanos del mismo tipo, en el que una cantidad diferente de dicho producto génico en la muestra comparada con la célula o tejido sanos es el diagnóstico de un estado relacionado con la telomerasa.

23. Kit para la detección de un gen de hTRT, producto génico, mutante o variante, comprendiendo dicho kit un polinucleótido según la reivindicación 1 o un polinucleótido que comprende una secuencia de por lo menos 12 nucleótidos, opcionalmente de por lo menos 15 nucleótidos, idéntica a, o exactamente complementaria a una secuencia contigua de un polinucleótido del apartado (a) de la reivindicación 1.

24. Kit para la detección de un gen de hTRT, producto génico, mutante o variante, comprendiendo dicho kit un polinucleótido que se puede obtener expresando un vector según la reivindicación 5.

25. Kit para la detección de un gen de hTRT, producto génico, mutante o variante, comprendiendo dicho kit una composición según la reivindicación 8.

26. Kit para la detección de un gen de hTRT, producto génico, mutante o variante, comprendiendo dicho kit un anticuerpo o su fragmento de unión según la reivindicación 14.

27. Polinucleótido según la reivindicación 1 o un polinucleótido que comprende una secuencia de por lo menos 12 nucleótidos, opcionalmente de por lo menos 15 nucleótidos, idéntica a, o exactamente complementaria a una secuencia contigua del polinucleótido del apartado (a) de la reivindicación 1, para su utilización como producto farmacéutico.

28. Polipéptido que se puede obtener mediante la expresión de un vector según la reivindicación 5, para su utilización como producto farmacéutico.

29. Composición según la reivindicación 8, para su utilización como producto farmacéutico.

30. Anticuerpo o fragmento de unión según la reivindicación 14, para su utilización como producto farmacéutico.

31. Utilización de un polinucleótido según la reivindicación 1 o de un polinucleótido que comprende una secuencia de por lo menos 12 nucleótidos, opcionalmente de por lo menos 15 nucleótidos, idéntica a, o exactamente complementaria a una secuencia contigua del polinucleótido del apartado (a) de la reivindicación 1, para la preparación de un medicamento.

32. Utilización de un polipéptido que se puede obtener mediante la expresión de un vector según la reivindicación 5, en la preparación de un medicamento.

33. Utilización de una composición según la reivindicación 8, en la preparación de un medicamento.

34. Utilización de un anticuerpo o fragmento de unión según la reivindicación 14, en la preparación de un medicamento.

35. Utilización de un polinucleótido según la reivindicación 1 o de un polinucleótido que comprende una secuencia de por lo menos 12 nucleótidos, opcionalmente de por lo menos 15 nucleótidos, idéntica a, o exactamente complementaria a una secuencia contigua del polinucleótido del apartado (a) de la reivindicación 1, en la preparación de un medicamento para aumentar la capacidad de proliferación de una célula de vertebrado, disminuir la capacidad de proliferación de una célula de vertebrado o tratar un estado asociado a un nivel elevado o disminuido de actividad de la telomerasa.

36. Utilización de un polipéptido que se puede obtener mediante la expresión de un vector según la reivindicación 5, en la preparación de un medicamento para aumentar la capacidad de proliferación de una célula de vertebrado, disminuir la capacidad de proliferación de una célula de vertebrado o tratar un estado asociado a un nivel elevado o disminuido de actividad de la telomerasa.

37. Utilización de una composición según la reivindicación 8, en la preparación de un medicamento para aumentar la capacidad de proliferación de una célula de vertebrado, disminuir la capacidad de proliferación de una célula de vertebrado o tratar un estado asociado a un nivel elevado o disminuido de actividad de la telomerasa.

38. Utilización de un anticuerpo o fragmento de unión según la reivindicación 14, en la preparación de un medicamento para aumentar la capacidad de proliferación de una célula de vertebrado, disminuir la capacidad de proliferación de una célula de vertebrado o tratar un estado asociado a un nivel elevado o disminuido de actividad de la telomerasa.

39. Composición farmacéutica que comprende un polinucleótido según la reivindicación 1 o un polinucleótido que comprende una secuencia de por lo menos 12 nucleótidos, opcionalmente de por lo menos 15 nucleótidos, idéntica a, o exactamente complementaria a una secuencia contigua del polinucleótido del apartado (a) de la reivindicación 1, opcionalmente junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

40. Composición farmacéutica que comprende un polipéptido que se puede obtener mediante la expresión de un vector según la reivindicación 5, opcionalmente junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

41. Composición farmacéutica que comprende una composición según la reivindicación 8, opcionalmente junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

42. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión según la reivindicación 14, opcionalmente junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

43. Utilización de un polinucleótido, que comprende una secuencia de por lo menos 12 nucleótidos, opcionalmente de por lo menos 15 nucleótidos, idéntica a o exactamente complementaria a una secuencia contigua del polinucleótido del apartado (a) de la reivindicación 1, en la preparación de una vacuna capaz de provocar una respuesta inmunitaria.

44. Utilización de una composición según la reivindicación 8, en la preparación de una vacuna capaz de provocar una respuesta inmunitaria.