Anticuerpo IGG contra CD3 híbrido humano/roedor, y métodos de construcción del mismo.

Un anticuerpo IgG que tiene una afinidad de unión por el complejo antigénico CD3 humano y que tieneuna región constante de la cadena pesada aglicosilada de tipo IgG humana y una región constante de la cadenaligera de tipo lambda humana

en cuyo anticuerpo la cadena pesada tiene un marco de la región variable junto con CDR que tienen lassecuencias de aminoácidos de las SEC ID No.

2, 4 y 6 ó las respectivas variantes modificadasconservativamente de las mismas y la cadena ligera tiene un marco de la región variable junto con CDRque tienen las secuencias de aminoácidos de las SEC ID No. 8, 10 y 12 o las respectivas variantesmodificadas conservativamente de las mismas

caracterizado por que el marco de la región variable de la cadena pesada corresponde en secuencia a lasecuencia de tipo humano y el marco de la región variable de la cadena ligera corresponde en secuencia aun marco de la región variable de la cadena ligera de rata o deriva de un marco de rata en el que serealizan una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en Gln-1 a Asp-1;Ala-2 a Phe-2: Val-3 a Met-3; Val-4 a Leu-4; Ala-7 a Pro-7; Asn-8 a His-8; Thr-12 a Glu-12; Leu-14 a Pro-14;Ser-16 a Lys-16; Lys-19 a Ile-19; Leu-20 a Ile-20; Leu-39 a Gln-39; Tyr-40 a Arg-40; Glu-41 a Pro-41; Ser-44 a Ala-44; Met-48 a Val-48; Tyr-50 a Phe-50; Phe-75 a Ser-75, His-79 a Ser-79; Asn-80 a Gly-80; Val-81a Leu-81; Ala-82 a Gln-82; Ile-83 a Thr-83; Ile-88 a Asp-88 y Phe-90 a Tyr-90

por medio de lo cual la región variable de la cadena ligera incluye suficientes aminoácidos específicos parala secuencia de tipo rata de manera que las cadenas ligeras y pesadas se asocian más fuertemente quecuando la región variable de cadena ligera es del correspondiente tipo totalmente humano.

Anticuerpo IGG contra CD3 híbrido humano/roedor, y métodos de construcción del mismo

La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos dirigidos contra el complejo antigénico CD3 humano, al ADN y al ARN que codifican la producción de estos anticuerpos, a las líneas celulares que contienen dicho ADN y/o ARN capaces de producirlos y a los métodos de producción de los anticuerpos utilizando el ADN, el ARN y/o las células.

El antígeno CD3 humano consta de un mínimo de cuatro cadenas polipeptídicas invariables, que están asociadas no-covalentemente a los receptores de células T sobre la superficie de las células T, y generalmente se conoce en laactualidad como complejo antigénico CD3. Éste está íntimamente implicado en el proceso de activación de las células T en respuesta al reconocimiento de antígenos por los receptores de las células T. Todos los anticuerpos monoclonales para CD3 pueden ser utilizados para sensibilizar las células T a estímulos proliferativos secundarios tales como IL1 (interleuquina 1) e IL2 (interleuquina 2) . Además, ciertos anticuerpos monoclonales para CD3 son a su vez mitogénicos para las células T. Esta propiedad es dependiente del isotipo y resulta de la interacción del dominio Fc del anticuerpo para con los receptores de Fc sobre la superficie de las células accesorias.

Los anticuerpos para CD3 de roedor se han utilizado para influir en el estado inmunológico mediante la supresión, mejora o redireccionamiento de las respuestas de las células T a los antígenos. Por lo tanto, tienen un potencial terapéutico considerable en el ser humano para su uso como agentes inmunosupresores, por ejemplo para el tratamiento de episodios de rechazo después del trasplante de aloinjertos renales, hepáticos y cardíacos.

El documento WO 92/06193 y sus equivalentes (GB 2249310A, Appn Nos. EP. 91917169.4, JP 516117/91) estudian el problema de la respuesta de antiglobulinas al anticuerpo para CD3 reestructurando o "humanizando" los genes de la región variable para los anticuerpos y expresándolos asociados con los genes de los dominios constantes humanos correspondientes. Esto reduce el contenido no humano del anticuerpo monoclonal a un nivel tan bajo que es poco probable una respuesta de antiglobulina.

El documento WO 93/19196 y sus equivalentes (por ejemplo, EP 0586617, US 5585097) estudian el problema de la respuesta a la primera dosis. Estos ilustran el uso de anticuerpos para CD3 aglicosilados humanizados de la subclase IgG que, sorprendentemente, conservan su especificidad de unión al antígeno y sus propiedades inmunosupresoras y sin embargo no inducen la mitogénesis de las células T in vitro e inducen un nivel reducido de liberación de citoquinas in vivo, mientras que todavía mantienen cierta capacidad de unión a Fc.

Si bien estos anticuerpos para CD3 tienen gran valor terapéutico, se ha demostrado que su producción en cultivos de células no es fácil. En la práctica, el rendimiento escaso de anticuerpos se encuentra acompañado por un crecimiento pobre de la línea de células transfectadas. Después de mucho trabajo durante varios años los mejores niveles de anticuerpos alcanzados han sido alrededor de 10 !g/ml, con células que expresan anticuerpos para CD3 que crecen muy lentamente. Además, estas células tienden a anularse con el tiempo en los sistemas de cartuchos huecos utilizados para la producción a gran escala.

El sistema vector para la Síntesis de Glutamina de Celltech PEE12 utilizado en la expresión antes mencionada de anticuerpos para CD3 proporciona rutinariamente una expresión de otros anticuerpos humanizados de alrededor de 200 !g/ml. La línea celular de hibridoma original de rata (YTH 12.5) se expresó a un nivel relativamente normal de 100 !g/ml en cultivo celular, lo que indica la escasa producción de anticuerpos que se asocia con la forma humanizada. Parece que son una o más de las proteínas humanizadas expresadas las que resultan tóxicas para las células, ya que después de la transfección de las células, éstas tienden a anularse más rápido de lo que crecen.

Los autores de la presente invención han encontrado ahora sorprendentemente que mediante la producción de una forma quimérica del anticuerpo anti-CD3, que une la región variable de la cadena ligera para CD3 de rata con la región constante lambda humana y la clonación de ésta en PEE12 que contiene la cadena pesada aglicosilada para CD3 humanizada, pueden producir líneas celulares de mieloma que proporcionan la expresión de anticuerpos para CD3 aglicosilados funcionales en 60 a 100 !g/ml de cultivo. Mediante el uso de la clonación por dilución limitante algunos de los clones se pueden seleccionar para proporcionar niveles aún más altos de expresión, por ejemplo del orden de 120 !g/ml, y permanecer estables en el cultivo a largo plazo con producción a gran escala sin ningún efecto adverso sobre el crecimiento celular. De este modo, los anticuerpos quiméricos de la presente invención ofrecen una buena capacidad de producción sin la respuesta de antiglobulina normalmente asociada con los anticuerpos derivados de rata.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un anticuerpo IgG que tiene afinidad de unión por el complejo antigénico CD3 en el que en la cadena pesada tiene un marco de la región variable junto con al menos una CDR seleccionada entre las secuencias de aminoácidos de los SEC ID No. 2, 4 y 6 y las respectivas variantes modificadas conservativamente de las mismas y la cadena ligera tiene un marco de la región variable con al menos una CDR seleccionada entre las secuencias de aminoácidos de los SEC ID No. 8, 10 y 12 y las respectivas variantes modificadas conservativamente de las mismas caracterizadas por que el marco de la región variable de la cadena pesada corresponde, en cuanto a la secuencia, a la secuencia de tipo humano y la región variable de la cadena ligera incluye uno o más de los aminoácidos específicos característicos de la secuencia de tipo roedor.

Preferiblemente, la región variable de la cadena ligera incluye suficientes aminoácidos específicos para la secuencia de tipo roedor de manera que las cadenas ligeras y pesadas se asocian más fuertemente que cuando la regiónvariable de cadena ligera es del tipo completamente humano correspondiente. Ésta puede ser convenientemente tal que la región variable de la cadena ligera se corresponda enteramente con la secuencia de roedor, por ejemplo, rata. Alternativamente se pueden incluir sólo algunos o incluso uno de los aminoácidos característicos de rata.

Los aminoácidos concretos que son de tipo roedor en lugar de tipo humano en la secuencia de la región variable de cadena ligera se seleccionan entre los que se muestran en la SEC ID No. 14 en la lista de secuencias adjunta, que es la secuencia marco de la región variable de la cadena ligera preferida donde han sido incluidos todos los posibles aminoácidos característicos del marco de rata posible, junto con las respectivas secuencias de CDR. Así los aminoácidos característicos de la región marco variable de la cadena ligera de rata del SEC ID No. 14 son: Gln-1, Ala-2, Val-3, Val-4, Ala-7, Asn-8, Thr-12, Leu-14, Ser-16, Lys-19, Leu-20, Leu-39, Tyr-40, Glu-41, Ser-44, Met-48, Tyr-50, Phe-75, Ser-79, Asn-80, Val- 81, Ala-82, Ile-83, Ile-88 y Phe-90. Los correspondientes aminoácidos humanos son en cada caso Asp-1, Phe-2, Met-3, Leu-4, Pro-7, His-8, Glu-12, Pro-14, Lys-15, Ile-19, Ile-20, Gln-39, Arg-40, Pro-41, Ala-44, Val-48, Phe-50, Ser-75, Ser-79, Gly-80, Leu-81, Gln-82, Thr-83, Asp-88 y Tyr-90. La última secuencia humana se ilustra en la página 6 del documento EP 0586617 B y en la correspondiente solicitud de patente de los Estados Unidos.

Convenientemente, el marco de la región variable de la cadena pesada es de tipo humano y la región variable de la cadena ligera es de tipo roedor, teniendo ésta todos los aminoácidos anteriormente mencionados del tipo de rata del SEC ID No. 14. Sin embargo, una o más, pero no todas estas posiciones del SEC ID No. 14 pueden ser del tipo humano, siempre y cuando se encuentre presente suficiente secuencia de roedor, p. ej. rata para permitir que se logre una interacción cadena ligera-cadena pesada estable por encima de la proporcionada por la forma completamente humanizada de la técnica anterior. Dicha interacción es preferentemente de tal manera que cuando el anticuerpo es expresado en células PEE 12 utilizando las instrucciones del proveedor (Celltech) se consigue un exceso de 50 !g/ml, más preferiblemente un exceso de 100 !g/ml. Preferiblemente, estas células no deben tender a anularse en un número significativo... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo IgG que tiene una afinidad de unión por el complejo antigénico CD3 humano y que tiene una región constante de la cadena pesada aglicosilada de tipo IgG humana y una región constante de la cadena ligera de tipo lambda humana en cuyo anticuerpo la cadena pesada tiene un marco de la región variable junto con CDR que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEC ID No. 2, 4 y 6 ó las respectivas variantes modificadas conservativamente de las mismas y la cadena ligera tiene un marco de la región variable junto con CDR que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEC ID No. 8, 10 y 12 o las respectivas variantes modificadas conservativamente de las mismas caracterizado por que el marco de la región variable de la cadena pesada corresponde en secuencia a la secuencia de tipo humano y el marco de la región variable de la cadena ligera corresponde en secuencia a un marco de la región variable de la cadena ligera de rata o deriva de un marco de rata en el que se realizan una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en Gln-1 a Asp-1; Ala-2 a Phe-2: Val-3 a Met-3; Val-4 a Leu-4; Ala-7 a Pro-7; Asn-8 a His-8; Thr-12 a Glu-12; Leu-14 a Pro-14; Ser-16 a Lys-16; Lys-19 a Ile-19; Leu-20 a Ile-20; Leu-39 a Gln-39; Tyr-40 a Arg-40; Glu-41 a Pro-41; Ser44 a Ala-44; Met-48 a Val-48; Tyr-50 a Phe-50; Phe-75 a Ser-75, His-79 a Ser-79; Asn-80 a Gly-80; Val-81 a Leu-81; Ala-82 a Gln-82; Ile-83 a Thr-83; Ile-88 a Asp-88 y Phe-90 a Tyr-90

por medio de lo cual la región variable de la cadena ligera incluye suficientes aminoácidos específicos para la secuencia de tipo rata de manera que las cadenas ligeras y pesadas se asocian más fuertemente que cuando la región variable de cadena ligera es del correspondiente tipo totalmente humano.

2. Un anticuerpo como se reivindica en la Reivindicación 1, caracterizado por que se proporciona la aglicosilación por tener una región constante de tipo humano con el motivo de N-glicosilación, Asparragina-X-serina o Asparragina-X-treonina, que tiene el residuo de asparragina sustituido por un aminoácido, distinto de prolina, que no puede estar glicosilado, o uno de los otros residuos del motivo alterado para impedir la glicosilación de la asparragina.

3. Un anticuerpo como se reivindica en las Reivindicación 1 o la Reivindicación 2, caracterizado por que la región variable de la cadena ligera se corresponde enteramente con la secuencia de rata.

4. Un anticuerpo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que las regiones marco humanas comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEC ID No. 21, 22, 23 y/o 24.

5. Un anticuerpo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que las CDR de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD3 de rata están presentes en un marco del dominio variable humano que tiene la lectura de la secuencia de aminoácidos en la dirección líder a región constante que comprende

SEC ID No. 21 / CDR / SEC ID No. 22 / CDR /SEC ID No. 23/ CDR / SEC ID No. 24.

6. Un anticuerpo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que comprende una región marco del dominio variable de la cadena ligera de la SEC ID No. 14.

7. Un anticuerpo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que comprende una cadena ligera quimérica de rata-humano y una secuencia de aminoácidos de la región constante lambda de la SEC ID No. 18.

8. Un anticuerpo aglicosilado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la región constante de la cadena pesada es de un isotipo IgG1.

9. Un anticuerpo aglicosilado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el residuo de asparragina de la posición 297 de la región constante de la cadena pesada es sustituido por un residuo de aminoácido alternativo.

10. Un anticuerpo aglicosilado de acuerdo con la Reivindicación 9, en el que el residuo de asparragina es sustituido por un residuo de alanina.

11. Un anticuerpo aglicosilado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que solo uno de los brazos del mismo tiene afinidad por el antígeno CD3.

12. Un anticuerpo aglicosilado de acuerdo con la Reivindicación 11, que es monovalente.

13. Un anticuerpo aglicosilado de acuerdo con la Reivindicación 12, en el que la mitad del anticuerpo consiste en una cadena pesada y una cadena ligera completas y la otra mitad consiste en una cadena pesada similar pero truncada que carece del dominio de la región variable y el primer dominio de la región constante.

14. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo aglicosilado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un diluyente o portador fisiológicamente aceptable.

15. Un anticuerpo aglicosilado de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 13, para su uso en terapia.

16. Un anticuerpo aglicosilado de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 13, para su uso en la inmunosupresión o el tratamiento del cáncer.

17. Un ácido nucleico recombinante que codifica un anticuerpo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 13.

18. Un ácido nucleico recombinante como se reivindica en la Reivindicación 17, caracterizado por que comprende una secuencia de nucleótidos de la SEC ID No. 13.

19. Un ácido nucleico recombinante como se reivindica en la Reivindicación 17 o 18, caracterizado por que comprende una secuencia de nucleótidos de la SEC ID No. 17.

20. Un ácido nucleico recombinante como se reivindica en una cualquiera de las 1. a 19, caracterizado por que codifica un péptido de la secuencia aminoácidos del SEC ID No. 20.

21. Un ácido nucleico recombinante como se reivindica en una cualquiera de las 1. a 20, caracterizado por que codifica una lectura de la secuencia de aminoácidos en la dirección líder a región constante

SEC ID No. 25 / CDR / SEC ID No. 26/ CDR / SEC ID No. 27 / CDR / SEC ID No. 28.

22. Un ácido nucleico recombinante como se reivindica en una cualquiera de las 1. a 21, caracterizado por que codifica una secuencia de aminoácidos de la SEC ID No. 14.

23. Un ácido nucleico recombinante como se reivindica en una cualquiera de las 1. a 22, caracterizado por que es ADN.

24. Un sistema de expresión de proteínas caracterizado por que comprende un ácido nucleico recombinante como se reivindica en una cualquiera de las 1. a 23.

25. Un sistema como se reivindica en la Reivindicación 24, caracterizado por que comprende un vector que incorpora el ácido nucleico reivindicado en una cualquiera de las 1. a 23.

26. Un sistema como se reivindica en la Reivindicación 24 o 25, caracterizado por que comprende constructos separados de ácido nucleico recombinante que codifican las cadenas pesada y ligera, respectivamente.

27. Un sistema como se reivindica en la Reivindicación 26, donde los constructos codifican cadenas con regiones constantes.

28. Una célula procariótica o eucariótica que expresa un anticuerpo como se reivindica en una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 13.

29. Una célula como se reivindica en la Reivindicación 28, caracterizada por que comprende un ácido nucleico como se reivindica en una cualquiera de las 1. a 23.

30. Una célula como se reivindica en la Reivindicación 28 o 29, caracterizada por que es una célula de mamífero inmortalizada.

31. Un procedimiento para producir un anticuerpo como se reivindica en una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 13, caracterizado por que comprende cultivar una célula como se reivindica en una cualquiera de las Reivindicaciones 28 a 30.