RECUPERACIÓN EFICAZ DE PROTEÍNAS REPLEGADAS CORRECTAMENTE.

Recuperación eficaz de proteínas replegadas correctamente. Campo de la invención [0001] La invención pertenece al campo de tratamiento y purificación de proteínas. Antecedentes [0002] Se han conseguido altos niveles de expresión de muchas proteínas de origen eucariota en hospedadores de expresión procariotas. Dichas proteínas eucariotas con frecuencia no se pliegan y se acumulan como cuerpos de inclusión insolubles en el hospedador procariota. Para obtener proteínas biológicamente activas, las proteínas atrapadas en los cuerpos de inclusión tienen que desplegarse y replegarse en condiciones rigurosas que incluyen agentes caotrópicos y tioles reductores. [0003] La expresión de proteínas de origen eucariota en hospedadores eucariotas evitaba estos problemas. Siempre que el vector de expresión se diseñara apropiadamente (por ejemplo, con péptidos señal de secreción, etc.), las líneas celulares eucariotas tendían a procesarse correctamente y secretar proteínas eucariotas extracelulares como productos solubles. [0004] La Solicitud de Patente Internacional publicada como documento WO 96/03141 A1 desvela proteínas quiméricas receptor de TNF:Fc que se expresan en células CHO y se purifican por medio de técnicas cromatográficas sin replegamiento. [0005] La solicitud EP 0 293 785 describe la expresión de TGF-1 recombinante en células CHO. La solicitud EP 0 433 225 describe un proceso para la producción de TGF-1, TGF-2 y TGF-3 en E. coli y Saccharomyces cerevisiae. 30 [0006] La solicitud EP 0 553 494 se refiere a la producción de interferón alfa humano en levaduras, y la publicación de revista titulada Purification and renaturation of Japanese encephalitis virus nonstructural glycoprotein NS1 overproduced by insect cells (Purificación y renaturalización de la glicoproteína no estructural del virus de la encefalitis japonesa NS1 sobreproducida por células de insecto) (Flamand et al., Protein Expression and Purification 6, 519-527, 1995) describe la proteína NS1 aislada a partir de células de insecto. [0007] Sin embargo, a medida que los sistemas de expresión y los vectores han mejorado para maximizar los niveles de expresión a partir de hospedadores eucariotas, no todas las proteínas recombinantes expresadas y secretadas a partir de estos hospedadores están en la conformación más activa deseada. La invención está diseñada para solucionar dichos problemas de expresión y maximizar rendimientos de proteínas biológicamente 40 activas. Sumario de la invención [0008] La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que no toda la preparación de proteínas 45 recombinantes que son expresadas por células hospedadoras eucariotas se pliega en una conformación terciaria nativa. Además, se ha descubierto que ciertas regiones o dominios de proteínas recombinantes pueden plegarse de forma apropiada, mientras que otras regiones o dominios pueden tener conformaciones indeseadas. Por consiguiente, la invención se refiere a un método para promover una conformación deseada de una forma soluble recombinante glicosilada de un receptor de TNF que ha sido secretado por una célula de mamífero, comprendiendo 50 el método poner en contacto una preparación de la forma soluble recombinante glicosilada del receptor de TNF que contiene una mezcla de al menos dos isómeros configuracionales de la forma soluble recombinante glicosilada del receptor de TNF con un reactivo de acoplamiento de reducción/oxidación, que es una fuente de un agente reductor, durante un tiempo suficiente para aumentar la proporción relativa del isómero configuracional deseado, y determinar la proporción relativa del isómero configuracional deseado en la mezcla, donde el isómero configuracional deseado 55 tiene una mayor afinidad de unión que un isómero configuracional indeseado por un ligando afín del receptor de TNF. AKO descrito en el presente documento es un método para poner en contacto una preparación de la proteína recombinante que contiene una mezcla de al menos dos isómeros de la proteína recombinante con un reactivo de acoplamiento de reducción/oxidación durante un tiempo suficiente para aumentar la proporción relativa del isómero conformacional deseado y determinar la proporción relativa del isómero conformacional deseado en la mezcla. Otro 60 aspecto descrito en la presente memoria es un método que incluye poner en contacto una preparación de una proteína recombinante que ha sido producida por células de mamífero con un reactivo de acoplamiento de reducción/oxidación, a un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 11, y aislar una fracción de la preparación de la proteína recombinante con una conformación deseada. Las proteínas recombinantes preferidas son proteínas recombinantes glicosiladas tales como, por ejemplo, las producidas por células eucariotas. También se describen 65 métodos para formular las preparaciones resultantes en una forma de dosificación unitaria estéril, y composiciones 2   producidas por los métodos de la invención. Breve descripción de las figuras [0009] Figura 1. Cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) de TNFR:Fc. Esta preparación de TNFR:Fc eluye durante HIC como tres picos característicos recogidos en la Fracción Nº 2 y Fracción Nº 3, como se indica. Figura 2. Análisis de Dicroísmo Circular de Fracciones Nº 2 y Nº 3. En la Figura 2 se muestran mediciones de Dicroísmo Circular UV Cercano expresadas en términos de elipticidad media de residuos. La Figura 2A presenta los datos espectrales; la línea para la Fracción Nº 3 es la más próxima a la flecha, destacando el desplazamiento negativo a aproximadamente 270 nM atribuido a las contribuciones disulfuro, y la línea para la Fracción Nº 2 es la línea continua más oscura. La Figura 2B presenta los datos de ajuste a la curva para la Fracción Nº 2 (línea de trazos pequeña) y la Fracción Nº 3 (línea de trazos mayor). Figura 3. Determinación de Peso Molecular Usando cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) en línea, dispersión de luz (LS), ultravioleta (UV), y detección del índice de refracción (RI) en serie (SEC en línea/UV/LS/RI). La Figura 3A es la Fracción Nº 3 y la Figura 3B la Fracción Nº 2. Las líneas de trazos verticales indican cuando en los cortes se evaluó la determinación del peso molecular en la región que rodeaba al pico principal. Figura 4. Análisis por Calorimetría Diferencial de Barrido de las Fracciones Nº 2 y Nº 3. La Figura 4A corresponde a los datos sin corregir y la Figura 4B presenta los datos corregidos con respecto al punto basal. Las transiciones térmicas de fusión están marcadas por líneas de trazos verticales. Las flechas indican un desplazamiento de entalpía. Las líneas de puntos horizontales en la Figura 4B se usan como referencia basal. Figura 5. Correlación de Fracción Nº 2 y Actividad de Unión. Se ensayaron seis preparaciones diferentes de TNFR:Fc (denominadas A a F), de seis líneas celulares diferentes, con respecto a la correlación entre el porcentaje de aumento en proporción de Fracción Nº 2 (rombos oscuros) y porcentaje de aumento en Unidades de Unión a TNF alfa (rombos claros). Figura 6. Efecto de Variación de la Concentración de Cisteína sobre la Conversión de la Fracción Nº 3 en Fracción Nº 2. Se trataron muestras de proteína con diversas concentraciones de cisteína (0,25-5,0 mM) y se evaluaron los cambios en la Fracción Nº 3 usando HIC. Se trataron cuatro lotes diferentes de TNFR:Fc durante 18 horas a la concentración de cisteína indicada en el eje x. El porcentaje de Fracción Nº 3 en cada lote que se convirtió en Fracción Nº 2 se representa en el eje y. Figura 7. Efecto de la Concentración de Cisteína sobre la Proporción de Fracción Nº 3. Se trataron muestras de proteína de cuatro lotes diferentes con diversas concentraciones de cisteína (0-50 mM) y el nivel resultante de Fracción Nº 3 se evaluó por HIC. Figura 8. Efecto de la Temperatura sobre Intercambio de Disulfuro. Se trataron fracciones de proteína a temperatura ambiente o a 4 grados C en presencia o ausencia de cobre durante diversos tiempos. La Figura 8A presenta cambios en la Fracción Nº 3 de HIC después de 6 horas y la Figura 8B presenta cambios en la Fracción Nº 3 de HIC después de 18 horas. Descripción detallada de la invención [0010] En la presente memoria se describen métodos para aumentar la recuperación de proteínas recombinantes 45 activas. En particular, se describen métodos para promover una conformación deseada de una proteína en preparaciones de una proteína recombinante. Significativamente, se describen métodos suaves para alterar la estructura de las proteínas sin necesitar el uso de tratamientos rigurosos con caótropos (tales como, por ejemplo, desnaturalizantes fuertes tales como SDS, clorhidrato de guanidinio o urea). El uso de estos métodos en preparaciones... [Seguir leyendo]

1. Un método para promover una conformación deseada de una forma soluble recombinante glicosilada de un receptor de TNF que ha sido secretado por una célula de mamífero, comprendiendo el método poner en contacto una preparación de la forma soluble recombinante glicosilada del receptor de TNF que contiene una mezcla de al menos dos isómeros configuracionales de la forma soluble recombinante glicosilada del receptor de TNF con un reactivo de acoplamiento de reducción/oxidación, que es una fuente de un agente reductor, durante un tiempo suficiente para aumentar la proporción relativa del isómero configuracional deseado y determinar la proporción relativa del isómero configuracional deseado en la mezcla, donde el isómero configuracional deseado tiene una mayor afinidad de unión que un isómero configuracional indeseado por un ligando afín del receptor de TNF. 2. El método de la reivindicación 1, en el que el receptor de TNF es un receptor de TNF p75. 3. El método de la reivindicación 1, en el que la forma soluble recombinante glicosilada del receptor de TNF contiene al menos dos dominios. 4. El método de la reivindicación 3, en el que al menos un dominio de la forma soluble recombinante glicosilada del receptor de TNF tiene una conformación estable, y al menos un dominio de la forma soluble recombinante glicosilada del receptor de TNF tiene una conformación inestable, uno con respecto al otro. 5. El método de la reivindicación 1, en el que la forma soluble recombinante glicosilada del receptor de TNF es una proteína de fusión Fc. 6. El método de la reivindicación 5, en el que la preparación de la forma soluble recombinante glicosilada del receptor de TNF se ha purificado en una columna de Proteína A o Proteína G. 7. El método de la reivindicación 1, en el que el contacto se realiza a un pH de 7 a 10. 8. El método de la reivindicación 7, en el que el pH es 8,6. 9. El método de la reivindicación 1, en el que el reactivo de acoplamiento de reducción/oxidación se selecciona del grupo que consiste en glutatión, cisteína, DTT (ditiotreitol), 2-mercaptoetanol y ditionitrobenzoato. 10. El método de la reivindicación 9, en el que el reactivo de acoplamiento de reducción/oxidación comprende glutatión reducido. 11. El método de la reivindicación 10, en el que el glutatión reducido está a una concentración de 1 mM a 10 mM. 12. El método de la reivindicación 9, en el que el reactivo de acoplamiento de reducción/oxidación comprende cisteína reducida. 13. El método de la reivindicación 9, en el que la relación entre tioles reductores en el reactivo de acoplamiento de reducción/oxidación y enlaces disulfuro en la proteína es de 320 tioles reductores:1 enlace disulfuro a 64.000 tioles reductores:1 enlace disulfuro. 14. El método de la reivindicación 1, en el que la concentración de proteína es de 0,5 a 10 mg/ml. 15. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de contacto se realiza durante 4 a 16 horas. 16. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de contacto se realiza a 25°C. 17. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de contacto se realiza a 4°C. 18. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de contacto se detiene por acidificación. 19. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación comprende una o más etapas cromatográficas. 20. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación comprende una reacción de unión. 21. El método de la reivindicación 1, que comprende aislar una fracción de la preparación de la forma soluble recombinante glicosilada del receptor de TNF con el isómero configuracional deseado. 22. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 21, que comprende formular el isómero configuracional deseado en una forma de dosificación unitaria estéril. 16   23. El método de la reivindicación 1, en el que el isómero configuracional deseado tiene una mayor afinidad de unión por un TNF. 24. El método de la reivindicación 23, en la que el TNF es TNF-alfa. 25. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 21, en el que la etapa de contacto se realiza en ausencia de dodecilsulfato sódico, urea o guanidinio HCl. 26. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 21, en el que la etapa de contacto se realiza en una solución esencialmente libre de caótropos. 17