MÉTODO DE PURIFICACIÓN DE LIGANDO APO-2/TRAIL UTILIZANDO CRISTALIZACIÓN EN FRÍO.

Método de purificación de ligando apo-2/trail utilizando cristalización en frío CAMPO DE LA INVENCIÓN [0001] La presente invención se refiere en general a la purificación de Apo2L/TRAIL que implica cristalización. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0002] Se han identificado diversas moléculas, tales como el factor de necrosis tumoral-alfa ("TNF-alfa"), el factor de necrosis tumoral-beta ("TNF-beta" o "linfotoxina-alfa"), la linfotoxina-beta ("LT-beta"), el ligando CD30, el ligando CD27, el ligando CD40, el ligando OX-40, el ligando 4-1BB, el ligando de Apo-1 (también denominado como ligando Fas o ligando CD95), el ligando de Apo-2 (también denominado como Apo2L o TRAIL), el ligando de Apo-3 (también denominado TWEAK), el APRIL, el ligando OPG (también denominado como ligando RANK, ODF o TRANCE), y el TALL-1 (también denominado BlyS, BAFF o THANK), como miembros de la familia de citocinas del factor de necrosis tumoral ("TNF") (Véase, por ejemplo, Gruss y Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687- 12690 (1996); Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992), WO 97/01633 publicada el 16 de enero de 1997; WO 97/25428 publicada el 17 de julio de 1997; Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998); Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Hahne et al., J. Exp. Med., 188: 1185-1190 (1998); WO98/28426 publicada el 2 de julio de 1998; WO98/46751 publicada el 22 de octubre de 1998; WO98/18921 publicada el 7 de mayo de 1998; Moore et al., Science, 285:260- 263 (1999); Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)). De entre estas moléculas, se ha publicado que TNF- alfa, TNF-beta, el ligando CD30, el ligando 4-1BB, el ligando Apo-1, el ligando Apo-2 (Apo2L/TRAIL) y el ligando Apo-3 (TWEAK) están implicadas en la muerte celular apoptótica. [0003] Apo2L/TRAIL se identificó hace varios años como un miembro de la familia de citocinas del TNF.(véase, por ejemplo, Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996)). El polipéptido Apo2L/TRAIL humano de longitud completa es una proteína transmembrana de Tipo II de 281 aminoácidos de longitud. Algunas células pueden producir una forma soluble nativa del polipéptido, a través del corte enzimático de la región extracelular del polipéptido (Mariani et al., J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)). Los estudios cristalográficos de las formas solubles del Apo2L/TRAIL revelan una estructura homotrimérica similar a las estructuras del TNF y de otras proteínas relacionadas (Hymowitz et al., Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Hymowitz et al., Biochemistry, 39:633- 644 (2000)). Sin embargo, se halló que el Apo2L/TRAIL, a diferencia de otros miembros de la familia del TNF, tiene una característica estructural única, ya que tres residuos de cisteína (en la posición 230 de cada subunidad en el homotrímero) se coordinan conjuntamente con un átomo de zinc, y la unión al zinc es importante para la estabilidad del trímero y su actividad biológica. (Hymowitz et al., ver más arriba; Bodmer et al., J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)). Cha et al., Immunity, 11: 253-261, 199 describe una estructura cristal de TRAIL humano de una resolución de 2,8 Å. [0004] Se ha publicado en la literatura que Apo2L/TRAIL puede desempeñar un papel en la modulación del sistema inmune, incluyendo las enfermedades autoinmunes tales como la artritis reumatoide, y en el tratamiento del VIH (véase, por ejemplo, Thomas et al., J. Immunol., 161:2195-2200 (1998); Johnsen et al., Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffith et al., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Song et al., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000); Jeremias et al., Eur. J. Immunol., 28:143-152 (1998); Katsikis et al., J. Exp. Med., 186:1365-1372 (1997); Miura et al., J. Exp. Med., 193:651-660 (2001)). [0005] Se ha publicado también que las formas solubles del Apo2L/TRAIL inducen la apoptosis en una variedad de células cancerosas in vitro, incluyendo de tumores de colon, pulmón, mama, próstata, vejiga urinaria, riñón, ovario y cerebro, así como de melanomas, leucemias y mieloma múltiple (véase, por ejemplo, Wiley et al., ver más arriba; Pitti et al., ver más arriba; Rieger et al., FEBS Letters, 427:124-128 (1998); Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 104:155- 162 (1999); Walczak et al., Nature Med., 5:157-163 (1999); Keane et al., Cancer Research, 59:734-741 (1999); Mizutani et al., Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13: 1817-1824 (1999); Yu et al., Cancer Res., 60:2384-2389 (2000); Chinnaiyan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)). Los estudios in vivo en modelos de tumor murino sugieren adicionalmente que el Apo2L/TRAIL, solo o en combinación con la quimioterapia o la terapia con radiación, puede ejercer efectos anti-tumorales sustanciales (véase, por ejemplo, Ashkenazi et al., ver más arriba; Walzcak et al., ver más arriba; Gliniak et al., Cancer Res., 59:6153-6158 (1999); Chinnaiyan et al., ver más arriba; Roth et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999)). A diferencia de muchos tipos de células cancerosas, la mayoría de los tipos de células humanas normales parecen ser resistentes a la inducción de apoptosis por ciertas formas recombinantes de Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., ver más arriba; Walzcak et al., ver más arriba). Jo et al., han descrito que una forma soluble de Apo2L/TRAIL, marcada con polihistidina, indujo in vitro la apoptosis en hepatocitos humanos aislados, pero no en hepatocitos no humanos (Jo et al., Nature Med., 6:564- 567 (2000); véase también, Nagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)). Se cree que ciertas preparaciones de Apo2L/TRAIL recombinante pueden variar en términos de propiedades bioquímicas y actividades biológicas sobre 2   células normales respecto a las enfermas, dependiendo, por ejemplo, de la presencia o ausencia de una molécula etiqueta, contenido de zinc, y % de contenido de trímero. (Véase, Lawrence et al., Nature Med., Carta al Editor, 7:383-385 (2001); Qin et al., Nature Med., Carta al Editor, 7:385-386 (2001)). [0006] Se cree que la inducción de varias respuestas celulares, mediadas por tales citocinas de la familia del TNF, se inicia a partir de su unión a receptores celulares específicos. Previamente, se identificaron dos receptores distintos del TNF de aproximadamente 55-kDa (TNFR1) y 75-kDa (TNFR2) (Hohman et al., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990); EP 417.563, publicada el 20 de marzo de 1991; Loetscher et al., Cell, 61:351 (1990); Schall et al., Cell, 61:361 (1990); Smith et al., Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991)). Se halló que esos TNFR compartían la estructura típica de los receptores de superficie celular, incluyendo las regiones extracelular, transmembrana e intracelular. Las partes extracelulares de ambos receptores también se hallaron forma natural como proteínas de unión a TNF solubles (Nophar, Y. et al., EMBO J., 9:3269 (1990); y Kohno, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:8331 (1990); Hale et al., J. Cell. Biochem. Suplemento 15F, 1991, p. 113 (P424)). [0007] La parte extracelular de los TNFR del tipo 1 y tipo 2 (TNFR1 y TNFR2) contiene un patrón de secuencia de aminoácidos repetitivos de cuatro dominios ricos en cisteínas (CRD) denominados del 1 al 4, que empiezan a partir del extremo NH2-terminal. (Schall et al., ver más arriba; Loetscher et al., ver más arriba; Smith et al., ver más arriba; Nophar et al., ver más arriba; Kohno et al., ver más arriba; Banner et al., Cell, 73:431-435 (1993)). Existe un patrón repetitivo de CDR similar en otras varias proteínas de la superficie celular, incluyendo el receptor del factor de crecimiento del nervio p75 (NGFR) (Johnson et al., Cell, 47:545 (1986); Radeke et al., Nature, 325:593 (1987)), el antígeno CD40 de la célula B (Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403 (1989)), el antígeno OX40 de la célula T (Mallet et al., EMBO J., 9:1063 (1990)) y el antígeno Fas (Yonehara et al., ver más arriba e Itoh et al., Cell, 66:233-243 (1991)). Los CDR también se hallan en las proteínas solubles T2 similares al TNFR (sTNFR) de los virus de la viruela de Shope y mixoma (Upton et al., Virology, 160:20-29 (1987); Smith et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 176:335 (1991); Upton et al., Virology, 184:370 (1991)). El alineamiento óptimo de estas secuencias indica que las posiciones de los residuos cisteína están bien conservadas. A estos receptores a menudo se les denomina de forma conjunta como... [Seguir leyendo]

1. Método de recuperación de Apo2L/TRAIL de una mezcla que comprende (a) cargar la mezcla en una columna de intercambio catiónico; (b) lavar la columna de intercambio catiónico con un tampón de equilibrio, mediante el cual se eliminan los componentes no unidos presentes en la mezcla; (c) eluir el Apo2L/TRAIL unido a la columna de intercambio catiónico con un tampón de elución: (d) enfriar gradualmente el eluato hasta una temperatura de aproximadamente 2 a 4°C utilizando una velocidad de enfriamiento no lineal para mantener un nivel de supersaturación constante a medida que progresa la cristalización, mediante lo cual el Apo2L/TRAIL precipita espontáneamente en una forma cristalina para producir una mezcla de aguas madre y cristales de Apo2L/TRAIL, y (e) recuperar Apo2L/TRAIL de la mezcla obtenida en la etapa (d) en una pureza de por lo menos aproximadamente el 99%. 2. Método según la reivindicación 1, en el que la mezcla cargada en la columna de intercambio catiónico es un medio de cultivo o lisato celular de células productoras de Apo2L/TRAIL. 3. Método según la reivindicación 2, en el que dicha mezcla es el lisato celular de células huésped de E. coli productoras de Apo2L/TRAIL. 4. Método según la reivindicación 3, en el que dicho lisato se aclara antes de cargarse en la columna de intercambio catiónico. 5. Método según la reivindicación 1, en el que el eluato obtenido en la etapa (c) se somete a la etapa de cristalización de (d) sin purificación adicional. 6. Método según la reivindicación 1, en el que la columna de intercambio catiónico es una columna SP-Sefarosa. 7. Método según la reivindicación 6, en el que el pH de la mezcla cargada en dicha columna es o se ajusta a aproximadamente 7,5. 8. Método según la reivindicación, en el que la elución de Apo2L/TRAIL se realiza en un tampón de elución que comprende NaCl 100-200 mM o Na2SO4 100-150 mM en un tampón que ajusta el pH a 7,5-7,8. 9. Método según la reivindicación 1, en el que en la etapa (d) el eluato se enfría desde una temperatura de aproximadamente 15 a 30 o C hasta una temperatura de aproximadamente 2 a 8 °C en aproximadamente 1 a 60 horas. 10. Método según la reivindicación 9, en el que en la etapa (d) el eluato se enfría hasta una temperatura de aproximadamente 2 a 8°C en aproximadamente 1 a 8 horas. 11. Método según la reivindicación 9, en el que en la etapa (d) el eluato se enfría hasta una temperatura de aproximadamente 2 a 8°C en aproximadamente 1 hora. 12. Método según la reivindicación 11, en el que en la etapa (d) el eluato se enfría hasta una temperatura de aproximadamente 4°C en aproximadamente 1 hora. 13. Método según la reivindicación 1, en el que el pH del eluato es o se ajusta a pH 7,0-8,0 antes de la cristalización. 14. Método según la reivindicación 13, en el que el pH del eluato es o se ajusta a aproximadamente 7,3 antes de la cristalización. 15. Método según la reivindicación 13, en el que el pH del eluato es o se ajusta a aproximadamente 7,5-8,0 después de la cristalización. 16. Método según la reivindicación 1, en el que en la etapa (d) la temperatura de aproximadamente 2 a 4°C se mantiene hasta que se consigue o casi se consigue la solubilidad en equilibrio de Apo2L/TRAIL. 17. Método según la reivindicación 16, en el que en la etapa (d) la solubilidad de Apo2L/TRAIL disminuye mediante la adición de un antidisolvente. 18. Método según la reivindicación 17, en el que dicho antidisolvente se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), MPD, etanol, isopropanol, y dioxano. 28   19. Método según la reivindicación 18, en el que el peso molecular del PEG se encuentra entre aproximadamente 400 y aproximadamente 10.000 daltons. 20. Método según la reivindicación 19, en el que el peso molecular del PEG es 400, 3.350 ó 10,000 daltons. 21. Método según la reivindicación 1, en el que en la etapa (e) se recupera Apo2L/TRAIL en forma de cristales separados de las aguas madre mediante filtración o centrifugación o una combinación de los mismos. 22. Método según la reivindicación 21, en el que el pH de las aguas madre se ajusta a aproximadamente 8,0 antes de la filtración para disminuir la solubilidad. 23. Método según la reivindicación 1, que comprende además las etapas de disolver los cristales de Apo2L/TRAIL obtenidos en la etapa (d) y someter la solución obtenida a una segunda etapa de purificación cromatográfica. 24. Método según la reivindicación 23, en el que dicha segunda etapa de purificación cromatográfica es cromatografía de interacción hidrofóbica. 25. Método según la reivindicación 24, en el que la cromatografía de interacción hidrofóbica se realiza en una columna de Fenil-Sefarosa. 26. Método según la reivindicación 23, en el que dicha segunda etapa de purificación cromatográfica es una cromatografía de intercambio catiónico. 27. Método según la reivindicación 26, en el que dicha cromatografía de intercambio catiónico se realiza en una columna CM-Sefarosa o SP Sefarosa. 28. Método según la reivindicación 23, en el que el Apo2L/TRAIL se recupera y se formula después de dicha segunda etapa de purificación cromatográfica mediante ultrafiltración-diafiltración. 29. Método según la reivindicación 1, en el que dicha pureza es por lo menos aproximadamente del 99,5%. 30. Método según la reivindicación 1, en el que dicha pureza es por lo menos aproximadamente del 99,9%. 29     % CRISTALIZADO Flujo de Columna SP Cristalizado Masa lavada 31 Masa de referencia Acetato Na Dímero Apo2L/TRAIL Monómero Apo2L/TRAIL Citrato Na   1 HORA 4 HORAS 24 HORAS 8 HORAS 32   Concentración de APO2L (mg/mL) Porcentaje de PEG (%) 33