METODO PARA PURIFICAR DIFERENTES FORMAS DE ALERGENOS BET V 1 RECOMBINANTES EXPRESADOS COMO AGREGADOS INSOLUBLES.

Procedimiento para la preparación de las siguientes variantes del alérgeno principal del polen de abedul Bet v 1 recombinantes y purificadas en forma soluble,

activas biológicamente y presentes en un medio fisiológico adecuado para utilizarse directamente en medicina:

- trímero,

- fragmento A (aminoácidos 1-74) y -fragmento B (aminoácidos 75-164),

a partir de agregados proteicos (cuerpos de inclusión) insolubles en el medio de expresión y que se han obtenido tras la expresión bacteriana, caracterizado porque se llevan a cabo las siguientes etapas:

(i) extracción de los agregados proteicos insolubles separados en los reactivos orgánicos desnaturalizantes,

(ii) purificación de la disolución obtenida en (i) mediante, como mínimo, una etapa cromatográfica con el uso de eluyentes esencialmente inorgánicos, alcalinos sin tamponar y salinos, en la que la etapa indispensable es una cromatografía de intercambio iónico, y

(iii) neutralización de la disolución alcalina obtenida tras la última etapa de purificación y que contiene la proteína disuelta, renaturalizada y biológicamente activa

Método para purificar diferentes formas de alergenos Bet v 1 recombinantes expresados como agregados insolubles.

La invención se refiere a un procedimiento para la solubilización y purificación de proteínas recombinantes que se expresan en células huésped bacterianas y se almacenan como agregados (inclusión bodies, cuerpos de inclusión) insolubles. La purificación se basa en la conversión de los mencionados "cuerpos de inclusión" a una forma soluble mediante el uso de reactivos desnaturalizantes orgánicos y el empleo de procedimientos cromatográficos. En este caso se seleccionan eluyentes inorgánicos, alcalinos y salinos que, tras la purificación efectuada, permiten obtener las proteínas recombinantes, después de la neutralización, en una forma fisiológicamente aceptable que se puede utilizar directamente para el uso médico. El procedimiento es especialmente adecuado para la purificación de alergenos y fragmentos de alergenos.

El procedimiento según la invención se lleva a cabo según las condiciones indispensables de la ciencia farmacéutica (GMP). Los principios activos farmacéuticos se pueden utilizar como medicamentos parenterales directamente tras la solubilización. Los alergenos o variantes alergénicas recombinantes preferidos que se preparan conforme al procedimiento según la invención pueden encontrar su uso en terapias mejoradas o bien en el diagnóstico de enfermedades alérgicas.

En la preparación de proteínas recombinantes mediante células huésped bacterianas o procariotas, como por ejemplo E. coli, un problemas general es que las proteínas que se expresan no presentan el correspondiente pliegue nativo correcto que normalmente se necesita para mostrar una actividad biológica completa. A menudo, el pliegue incorrecto provoca que una serie de proteínas sólo se presenten en forma insoluble en el medio de expresión, es decir, se almacenan en forma de agregados, los cuales han irrumpido en la bibliografía científica como los conocidos "cuerpos de inclusión". La formación de los llamados "cuerpos de inclusión" repercute negativamente en la purificación y la necesaria disponibilidad en disolución de la proteína recombinante expresada (Marston y col., 1986, Biochem J. 240: 1-12). Para poder purificar las proteínas recombinantes almacenadas en bacterias, a menudo se añaden a los eluyentes cromatográficos sustancias desnaturalizantes, como por ejemplo urea o clorhidrato de guanidinio. Sin embargo, estos aditivos no son compatibles con todos los métodos de separación, como por ejemplo la cromatografía de interacción hidrofóbica. Además, los productos se pueden modificar desfavorablemente mediante reacciones químicas, como por ejemplo mediante cianato, que se puede formar en las disoluciones de urea. La extracción del medio desnaturalizante y con ello la posible renaturalización normalmente se efectúa por diálisis, diafiltración o filtración de gel. Estos procesos no sólo son largos, sino que a menudo provocan una nueva precipitación del producto. Es difícil comprobar analíticamente la eliminación completa en el producto final de los medios desnaturalizantes arriba mencionados. El problema expuesto arriba es de especial importancia en la preparación y purificación de alergenos y variantes alergénicas recombinantes.

En las últimas décadas, las alergias de tipo 1 han crecido drásticamente por todo el mundo. En los países industrializados, hasta un 20% de la población sufre dolencias, como la rinitis alérgica, la conjuntivitis o el asma bronquial, provocadas por alergenos que se encuentran en el aire (aeroalergenos) y que son liberados por diferentes fuentes como el polen de las plantas, los ácaros, los mamíferos (gatos, perros, caballos) y los mohos. Las alergias graves también se pueden producir por picaduras de insectos, como por ejemplo de abejas y avispas.

Las sustancias que provocan las alergias de tipo 1 son proteínas, glicoproteínas o polipéptidos. En personas sensibilizadas, tras la absorción en las mucosas o tras la picadura, estos alergenos reaccionan con los anticuerpos IgE que están unidos a la superficie de los mastocitos. Si dos o más anticuerpos IgE se enlazan mediante un alérgeno, esto provoca la liberación de mediadores (p. ej. histamina, prostaglandinas) y citoquinas en las células efectoras y con ello se desencadenan los síntomas alérgicos. Con la ayuda de secuencias de ADNc es posible preparar alergenos recombinantes que se puedan utilizar en el diagnóstico y la terapia de alergias (Scheiner y Kraft, 1995, Allergy 50, 384-391). Los alergenos recombinantes pueden alcanzar una especial importancia en los métodos de diagnóstico que hacen posible la identificación de los espectros de sensibilización de IgE individuales en comparación con extractos convencionales. Aparte de esto, son posibles las modificaciones selectivas por ingeniería genética de los alergenos recombinantes mediante las cuales se puede obtener un potencial alergénico reducido, manteniendo inalterada la reactividad con las células T auxiliares reguladoras (Schramm y col., 1999, J. Immunol. 162 (4): 2406-2414; Valenta y col., 1999, Biol. Chem. 380: 815-24; Singh y col., 1999, Int. Arch. Allergy Immunol. 119: 75-85). Estas variantes alergénicas son futuros candidatos prometedores para la inmunoterapia específica de las alergias de tipo 1. En especial, el último alérgeno modificado mencionado es objeto del procedimiento según la invención.

En este contexto, es de especial importancia la producción de alergenos y variantes alergénicas recombinantes en los sistemas de expresión bacterianos más utilizados. Estos sistemas, en comparación con los sistemas eucariotas, ofrecen la ventaja de que se obtienen rendimientos de producto elevados incluso después de tiempos de expresión cortos. Además, desde el punto de vista farmacológico, presentan un riesgo mucho menor en cuanto a las contaminaciones virales y a los oncogenes. Sin embargo, en su preparación recombinante en sistemas de expresión bacterianos, los principales alergenos de diferentes fuentes, como por ejemplo los alergenos del polen de hierba del grupo 1 (Vrtala y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 97: 781-7) y 13 (Suck y col., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332), el alérgeno de ácaros Der f 2 (Iwamoto y col., 1996, Int. Arch. Allergy Immunol. 109: 356-61) así como los alergenos del veneno de insectos fosfolipasa A2 y hialuronidasa (Soldatova y col., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 101: 691-8; Kuchler y col., 1989, Eur. J. Biochem. 184: 249-254) se almacenan como cuerpos de inclusión en las células huésped. Incluso las variantes alergénicas, como por ejemplo los fragmentos y multímeros del alérgeno principal del polen de abedul Bet v 1 (fragmento A, fragmento B, trímero Bet v 1) se comportan de este modo, a pesar de que el alérgeno recombinante Bet v 1 sin modificar es en gran parte soluble (Hoffmann-Sommergruber y col., 1997, Prot. Expr. Purific. 9:233-39; van Hage-Hamsten et al., 1999, J. Allergy Clin. Immunol. 104: 969-7).

Por consiguiente, la tarea consiste en poner a punto un procedimiento que permita purificar proteínas recombinantes existentes en forma de "cuerpos de inclusión", en especial alergenos, o proteínas con efecto alergénico, de un modo fácil y eficaz que evite los inconvenientes arriba mencionados del procedimiento según el estado de la técnica. Aparte de eso, la tarea consiste en obtener las proteínas de modo que durante y, en especial, al final de la purificación se encuentren en una forma que permita que se puedan poner a disposición para el uso médico o diagnóstico directamente y sin más procesamiento.

La presente invención trata de un método de purificación bioquímico que, mediante un procedimiento de purificación de una o varias etapas, preferiblemente de una a tres etapas, de las variantes recombinantes del alérgeno principal del polen de abedul Bet v 1, que existen en forma de cuerpos de inclusión tras su expresión, proporciona una presentación pura de las proteínas con el uso de eluyentes básicamente alcalinos sin tamponar.

La invención también trata de un procedimiento en el que las proteínas recombinantes permanecen en disolución tras la última etapa de purificación mediante una neutralización rápida. De este modo, al mismo tiempo se produce la creación de un medio fisiológico.

En el sentido de la invención, se entiende como variantes alergénicas los fragmentos, los multímeros, como por ejemplo dímeros o trímeros, aunque también las modificaciones de los alergenos originales o de sus fragmentos/multímeros. Por último, en el sentido de la invención se presentan inserciones, deleciones o sustituciones...

1. Procedimiento para la preparación de las siguientes variantes del alérgeno principal del polen de abedul Bet v 1 recombinantes y purificadas en forma soluble, activas biológicamente y presentes en un medio fisiológico adecuado para utilizarse directamente en medicina:

- trímero,

- fragmento A (aminoácidos 1-74) y -fragmento B (aminoácidos 75-164),

a partir de agregados proteicos (cuerpos de inclusión) insolubles en el medio de expresión y que se han obtenido tras la expresión bacteriana, caracterizado porque se llevan a cabo las siguientes etapas:

(i) extracción de los agregados proteicos insolubles separados en los reactivos orgánicos desnaturalizantes,

(ii) purificación de la disolución obtenida en (i) mediante, como mínimo, una etapa cromatográfica con el uso de eluyentes esencialmente inorgánicos, alcalinos sin tamponar y salinos, en la que la etapa indispensable es una cromatografía de intercambio iónico, y

(iii) neutralización de la disolución alcalina obtenida tras la última etapa de purificación y que contiene la proteína disuelta, renaturalizada y biológicamente activa.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque las variantes recombinantes mencionadas presentan una actividad IgE nula o disminuida, aunque mantienen la actividad con las células T.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque se utiliza urea o clorhidrato de guanidinio como reactivo desnaturalizante.

4. Procedimiento la reivindicación 1 a 3, caracterizado porque se elimina el reactivo desnaturalizante de la disolución de desnaturalización, en el que la proteína recombinante disuelta se enlaza a un material cromatográfico y la disolución desnaturalizada se intercambia frente un eluyente esencialmente inorgánico, alcalino sin tamponar, que presenta una concentración de sal entre 5 y 50 mM, que asegura un enlace de la proteína sobre el mencionado material de intercambio.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque la proteína recombinante enlazada se eluye mediante un aumento de la concentración de sal y de este modo se separa de las impurezas.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque el aumento de concentración de sal se realiza mediante un gradiente.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones de la 4 a la 6, caracterizado porque se utiliza un intercambiador aniónico como material cromatográfico.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones de la 4 a la 7, caracterizado porque, como mínimo, se lleva a cabo otra etapa de purificación cromatográfica.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque como etapa cromatográfica adicional se lleva a cabo una cromatografía de interacción hidrofóbica y/o una filtración de gel.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones de la 1 a la 9, caracterizado porque se utiliza NaOH, NaHCO₃ y NaCl como eluyente cromatográfico.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones de la 1 a la 10, caracterizado porque tras la purificación efectuada, la neutralización se realiza en un intervalo de valores de pH entre 6,5 y 8,0.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque se utiliza HCl para llevar a cabo la neutralización.