La presente invención describe antígenos vacunales quiméricos contra el virus que causa la enfermedad de la Peste Porcina Clásica(VPPC).

Dichos antígenos vacunales están basados en subunidades virales que están acopladas a moléculas proteicas estimuladoras del sistema inmune, tanto celular como humoral. Los antígenos quiméricos pueden ser producidos en sistemas de expresión que garantizan un correcto plegamiento tridimensional de las moléculas quiméricas que constituyen la base de la presente invención. Las composiciones vacunales que contienen dichos antígenos quiméricos inducen una respuesta inmune potente y temprana en los cerdos vacunados, confiriéndole una protección total contra el VPPC. Además, lascomposiciones vacunales resultantes previenen la transmisión viral de las madres a su descendencia. Los antígenos quiméricos, asícomo las composiciones vacunales resultantes son aplicables a laesfera de la salud animal, como vacunas para uso preventivo en porcinos

Campo técnico

La presente invención se refiere a la salud animal, en particular a nuevos antígenos quiméricos que incluyen subunidades virales del Virus de la Peste Porcina Clásica (VPPC) acopladas a proteínas que pueden estimular el sistema inmunológico celular y humoral, desarrollando un respuesta inmunológica potente y rápida contra dicho virus en cerdos.

Técnica anterior

La Peste Porcina Clásica (PPC), también conocida como cólera porcino por su carácter altamente infeccioso y por su distribución mundial, es considerada la enfermedad más importante en cerdos y se incluye en el listado de enfermedades notificadas de la Organización Mundial de la Salud Animal. El agente etiológico de esta enfermedad, VPPC, es un virus del género Pestivirus de la familia Flaviviridae. Se sabe que es un virus con una cubierta lipídica, con un diámetro de 40 a 60 nm y simetría hexagonal, con ácido ribonucleico (ARN) monocatenario como material genético (Kummerer y col. (2000)). The genetic basis for qytopathogenicity of pestiviruses. Vet. Microbiol. 77:117-128; Moenning y col. (2003). Clinical signs and epidemiology of Classical Swine Fever; a review of new Knowledge. Vet. Journal 165: 11-20).

La PPC es una enfermedad altamente contagiosa, en su forma aguda presenta fiebre, degeneración de los vasos capilares, necrosis de los órganos internos y muerte. Los primeros síntomas clínicos aparecen tras un período de incubación de 2 a 6 días, produciendo pirexia, reducción de movimientos y anorexia, produciéndose un empeoramiento en los días siguientes y pudiendo alcanzar la temperatura corporal 42 ºC. De igual forma, se desarrolla leucopenia, con valores leucocitarios menores de 8000/mm3. El cerdo también desarrolla conjuntivitis, estreñimiento seguido de diarrea, vómitos, pérdida de coordinación motriz, convulsiones, parálisis muscular en la fase terminal. Se aprecia un color rojo difuso de la piel a lo largo de todo el abdomen, morro, orejas y parte interna de las extremidades. En la mayoría de los casos letales la histopatología cerebral muestra una encefalitis no supurativa con elevada vascularización (Moenning y col. (2002) Clinical Signs and Epidemiology of Classical Swine Fever. A review of new knowledge. Vet. Journal 161:1-10).

El VPPC actúa como un inmunosupresor durante la infección (Susa y col. (1992) Patogénesis of Classical Swine Fever: B-lymphocyte deficiency caused by Hog Cholera virus. J. Virol. 66:1171-1175) y la detección de anticuerpos neutralizantes comienza a las 2 y 3 semanas después de la infección (Laevens y col. (1998. An experimental infection with a classical swine fever virus in weaner pigs. II). The use of serological data to estimate the day of virus introduction in natural outbreaks. Vet. Q. 20:46-49). La fase terminal de la infección está asociada a una notable disminución de linfocitos B en el sistema circulatorio, así como en el tejido linfoide (Susa y col. (1992). Patogénesis of Classical Swine Fever: B-lymphocyte deficiency caused hog cholera virus. J. Virol. 66: 1171-1175). La mayoría de los credos que desarrollan la enfermedad mueren entre 10 y 20 días después de la infección, con una mortalidad por encima del 95 %. Las lesiones post mortem características de la PPC son diátesis hemorrágicas con petequias en la mayoría de los sistemas de órganos. Resultan más frecuentes en riñón, vejiga urinaria y ganglios linfáticos, aunque también pueden aparecer en el bazo, laringe y en la membrana mucosa y serosa (Mouwen y col. (1983) Atlas of Veterinary Pathology, Bunge, Utrecht, Países Bajos).

La infección transplacentaria es otra forma clínica de la PPC; en este caso el virus puede atravesar la placenta de la cerda preñada infectando al feto. Las consecuencias de esta infección pueden ser aborto, el nacimiento de individuos muertos, momificaciones, malformaciones, nacimiento de individuos debilitados y problemas en la diferenciación de órganos. Dependiendo del tiempo de gestación en el que se produce la infección, pueden nacer descendientes inmunotolerantes al VPPV como consecuencia de infección a través de la cerda (transmisión vertical). Los lechones continúan infectados y son virémicos hasta que mueren, generando una diseminación del VPPC estable enfocada en la piara (Moenning y col. (2003) Clinical Signs and Epidemiology of Classical Swine Fever: a review of new knowledge. Vet. Journal 165:11-20) La mortalidad asociada a la PPC constituye un problema económico para los países afectados, con una clara influencia sobre el perjuicio de la situación económica y social de los países en vías de desarrollo. Por este motivo, en aquellos países con una elevada densidad porcina y elevada frecuencia del virus, resulta necesario aplicar programas de control basados en la vacunación. En los países muy desarrollados en los que las explotaciones porcinas se encuentran principalmente subvencionadas por los gobiernos, como Europa, Estados Unidos y Canadá, se aplica un procedimiento de erradicación basado en el sacrificio sanitario. No obstante, los costes resultan muy elevados y esos países son aún susceptibles de posibles epizootias.

La Unión Europea (EU) es considerada una zona de alto riesgo de re-emergencia de nuevas epizootias del VPPC debido a la elevada densidad de población porcina, la política de no vacunación y su proximidad geográfica con los países del Este de Europa, en los que el VPPC es enzoótico. Uno de los problemas asociados con la emergencia de nuevas epizootias en esta zona es la presencia de jabalíes con infecciones endémicas de PPC (Laddomada (2000) Incidente and control of PPC in wild boars in Europe. Vet. Microb. 73: 121-130). Esta aparición de nuevas epizootias ha tenido lugar a pesar de los sólidos programas de control que se han llevado a cabo en la Unión Europea, que incluyen el sacrificio sanitario de toda la población contagiada y la restricción de exportación porcina desde las zonas afectadas a las zonas sin la enfermedad (van Oirschot (2003) Vaccinology of Classical Swine Fever: from lab to field. Vet. Microbiol. 96:367-384). Por tanto, existe una necesidad de desarrollar vacunas que induzcan una respuesta inmune, rápida y segura, que garanticen la protección contra la infección y la transmisión viral.

Se han desarrollado vacunas frente al VPPC basadas en virus intactos: vacunas con virus inactivados con violeta cristal o formalina (Biront y col. (1988) Classical swine fever related infections. Liess B.M. Martines Nijhoff Publishing, Boston: 181-200), vacunas con virus atenuados por medio de pases en conejo, como la cepa Sinlak (Baibikov y col. RU 2182495) y la cepa china lapinizada (Dahle y col. (1995) Assessment of safety and protective value of a cell culture modified strain C vaccine of hog cholera/classical swine fever virus. Berl-Munch. Tieraztl.Wsch, 108:20-25), o vacunas con virus atenuado en cultivos tisulares procedentes de conejo, cobaya y cerdo (Kachiku y col. JP 73001484; Terpstra y col. (1990) Development and properties of a cell culture produced for hog cholera based on Chinese strain. Ditsh. Tierarz-tl.Wsch. 97:77-79). Estos tipos de vacunas suponen un riesgo debido a la posibilidad de que contengan fracciones de virus activos que, una vez inoculadas en animales susceptibles, producirán nuevos brotes de PPC. Además, en algunos casos, para obtener la respuesta inmunológica protectora, se requieren inmunizaciones repetitivas ya que la inactivación afecta a las propiedades inmunogénicas del virus.

En el caso específico de vacunas vivas con virulencia atenuada, presentan el riesgo potencial de que ocurra una atenuación parcial o una reversión de la virulencia. En cualquiera de estos casos se producirán partículas virales patógenas, que una vez inoculadas en animales susceptibles, permiten la infección, la enfermedad clínica y la propagación de la PPC en las piaras. Estos problemas ocasionan un mayor riesgo en las cerdas preñadas ya que el virus puede infectar a los fetos, que son altamente susceptibles, y la descendencia infectada propaga la enfermedad.

Existen vacunas basadas en cepas del VPPC cuya atenuación se ha demostrado, como la cepa China C, cepa PAV 250, cepa Thierval y cepa IFFA/A-49.

(Björlund, H.JV. y col. (1998) Molecular characterization of the 3 noncoding region of classical swine fever virus vaccine strains. Virus Genes 16:307-312, Launais y col. (1978) Hog Cholera Virus: Active immunization of piglets with the Thiverval strain in the presence and absence of colostral passive immunity. Vet. Microbiology 3:31-43). Estas cepas se emplean únicamente en los países en los que la enfermedad es enzoótica, ya que tienen... [Seguir leyendo]

1. Un antígeno de vacuna de proteína quimérica contra el Virus de la Peste Porcina Clásica (VPPC), que comprende una subunidad viral como inmunógeno fusionado o conjugado químicamente a una proteína estimuladora del sistema inmunológico, en el que la subunidad viral es el segmento extracelular de la glucoproteína E2 de la cubierta viral del VPPC y en el que la proteína estimuladora del sistema inmunológico es el segmento extracelular de la molécula CD154.

2. El antígeno quimérico de vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el segmento extracelular de la molécula CD154 puede proceder de cualquier mamífero.

3. El antígeno quimérico de vacuna de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del segmento extracelular de la glucoproteína E2 procedente del VPPC es la Sec. ID. Nº: 1, y el segmento extracelular de la molécula CD154 porcina es la Sec. ID. Nº: 2.

4. El antígeno quimérico de vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que puede obtenerse por vía recombinante, sintética o por medio de conjugación química.

5. El antígeno quimérico de vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que puede obtenerse partiendo de leche de mamíferos no humanos modificados genéticamente que expresa el antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en las células epiteliales mamarias.

6. El antígeno quimérico de vacuna de acuerdo con la reivindicación 5, que puede obtenerse partiendo de leche de mamíferos no humanos no transgénicos, por medio de transformación genética directa de la glándula mamaria.

7. El antígeno quimérico de vacuna de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la transformación genética directa de la glándula mamaria puede obtenerse empleando vectores adenovirales.

8. El antígeno quimérico de vacuna de acuerdo con la reivindicación 5, que puede obtenerse partiendo de leche de mamíferos transgénicos no humanos que expresa el antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en las células epiteliales mamarias.

9. El antígeno quimérico de vacuna de acuerdo con la reivindicación 4, que puede obtenerse partiendo de levaduras modificadas genéticamente que expresan el antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

10. Una formulación de vacuna capaz de producir una respuesta inmunológica protectora contra el VPPC, caracterizada porque contiene los antígenos quiméricos descritos en una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para su uso como un medicamento.

11. La formulación de vacuna para su uso como medicamento de acuerdo con la reivindicación 10, para administrar a animales por vía sistémica o mucosa.