Un polinucleótido aislado que comprende: (a) la secuencia de SEQ ID NO:

1; (b) una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 4 o (c) un complemento de lo anterior

Nueva isoforma del inhibidor del crecimiento celular endotelial vascular (VEGI).

Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente provisional de EE.UU. de nº de serie 60/331.190, presentada el 9 de noviembre de 2001.

Apoyo del gobierno

Esta invención se realizó con el apoyo del Gobierno de los EE.UU. de acuerdo con la subvención del Departamento de Defensa DAMD17-98-1-8093; la subvención de los Institutos Nacionales de la Salud NHLB1 RO1 HL60660; y la subvención del Instituto Nacional del Cáncer CA58185-08. El Gobierno tiene ciertos derechos en la invención.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones que son útiles en el tratamiento de afecciones en las que es ventajoso que se inhiba la angiogénesis, por ejemplo, en el tratamiento de tumores sólidos, retinopatía diabética, sarcoma de Kaposi, psoriasis, y artritis reumatoide. En particular, la invención se refiere a isoformas nuevas de inhibidores del crecimiento endotelial vascular (VEGIs), a sus secuencias de ADN y de las proteínas asociadas, a las composiciones y variantes de las mismas, y a su uso en el tratamiento de las enfermedades controladas por la angiogénesis.

Antecedentes de la invención

En condiciones fisiológicas normales, los humanos y los animales experimentan la angiogénesis, la generación de vasos sanguíneos nuevos en un tejido u órgano, en situaciones limitadas muy específicas. Por ejemplo, la angiogénesis se observa normalmente en la cicatrización de heridas, el desarrollo embrionario, y la formación del cuerpo lúteo, el endometrio y la placenta. El término "endotelio" significa una fina capa de células epiteliales planas que recubre las cavidades serosas, los vasos linfáticos y los vasos sanguíneos. El término "anti-angiogénico" o "actividad de inhibición angiogénica" significa la capacidad de una molécula de inhibir la angiogénesis en general.

Se cree que la angiogénesis controlada e incontrolada se desarrolla de una manera similar. Las células endoteliales están implicadas activamente en la inflamación, adhesión celular, coagulación, trombosis, fibrinolisis, y angiogénesis. Las células endoteliales y los pericitos, rodeados por una membrana basal, forman los vasos sanguíneos capilares. La angiogénesis comienza con la erosión de la membrana basal mediante las enzimas liberadas por las células endoteliales y los leucocitos. Las células endoteliales, que tapizan la luz de los vasos sanguíneos, sobresalen después a través de la membrana basal. Los agentes estimulantes angiogénicos inducen la migración de las células endoteliales a través de la membrana basal erosionada. Las células que migran forman un "brote" desde el vaso sanguíneo de origen, en el que las células endoteliales experimentan la mitosis y proliferan. Los brotes endoteliales se fusionan entre sí para formar asas capilares, por lo que se crea el vaso sanguíneo nuevo.

La angiogénesis no regulada persistente se da en una diversidad de estados patológicos, metástasis tumoral y crecimiento anormal de las células endoteliales, y favorece las lesiones patológicas observadas en estas afecciones. Los diversos estados patológicos en los que está presente la angiogénesis no regulada se han agrupado entre sí como enfermedades dependientes de la angiogénesis o asociadas a la angiogénesis.

Durante el crecimiento tumoral, las células endoteliales proliferan, invaden el estroma, migran hacia la fuente de estímulos angiogénicos tales como las células cancerosas, interaccionan con las células perivasculares y las células del estroma, y finalmente forman vasos capilares que unen el tejido tumoral con la circulación (J. Folkman (1995) Nat. Med. 1: 27-31). Aunque todavía no se comprende el mecanismo indudablemente complejo que regula la angiogénesis, cada vez es más evidente que la iniciación o la terminación del proceso es el resultado de un equilibrio entre reguladores positivos y negativos de la angiogénesis. Se han descrito varios factores angiogénicos, a menudo notablemente aumentados en los tejidos tumorales, que incluyen varios miembros de la familia de factores de crecimiento de fibroblastos, tales como FGF-I (G. Gimenez-Gallego et al. (1985) Science 230.: 1385), FGF-2 (L. Schweigerer et al. (1987) Nature 325: 257), y los de la familia de factores de crecimiento de células endoteliales vasculares (VEGF) (D. W. Leung et al. (1989) Science 246: 1306), así como los receptores de estos factores de crecimiento (L. W. Burrus y B. B. Olwin (1989) J. Biol. Chem. 264: 18647; S. Wemistrom et al. (1991) Growth Factors 4: 197; B. Tennan et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 187: 1579. C. de Vries et al., (1992) Science 255: 989). Recientemente, se ha descubierto que dos factores proteicos nuevos, la proliferina y una proteína relacionada con la proliferina, participan en la regulación de la iniciación y la finalización de la neovascularización en placenta de ratón (Jackson D, et al. Science 266, 1581-4, 1994).

También se ha informado de varios inhibidores de la angiogénesis, que incluyen la trombospondina (D. J Good et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:6624), angiostatina (M. S. O'Reilly et al. (1994) Cell 79:315), endostatina (M.S. O'Reilly et al. (1997) Cell 88: 277) y el factor plaquetario-4 (E. Maione et al. (1997) Science 247:77). Es evidente que la angiogénesis normal se activa rápidamente cuando es necesario, y finaliza rápidamente cuando ya no es necesaria, mientras la angiogénesis patológica, una vez iniciada, a menudo se prolonga y se detiene con dificultad. Esto indica que el mecanismo de regulación negativa que funciona en un proceso de angiogénesis normal está ausente o inhibido en un proceso de angiogénesis patológica. Se ha propuesto que las actividades proteolíticas que liberan los inhibidores de la angiogénesis de varios precursores pueden justificar en parte la inhibición de la angiogénesis, tal como se indica mediante la activación proteolítica de angiostatina a partir del plasminógeno y la de endostatina a partir del colágeno XVIII (M. S. O'Reilly, (1997) Cell 88:277). Muchos de los reguladores conocidos de la angiogénesis son pleiotrópicos y pueden actuar sobre otros tipos de células además del que produce los reguladores, aunque es posible que las células endoteliales puedan producir factores autocrinos para inhibir un proceso angiogénico o mantener la inactividad de una vasculatura madura. Por lo tanto, un objetivo de la presente solicitud es describir reguladores negativos autocrinos nuevos de la angiogénesis de una clase denominada Inhibidores del Crecimiento de Células Endoteliales Vasculares (VEGI) que son expresados específicamente por las células endoteliales.

La solicitud PCT publicada WO 99/23105 describe una proteína VEGI (VEGI-₁₇₄) y una variante de corte y empalme VEGI-₂₅₁ y sus secuencias nucleotídicas correspondientes. Se describió la actividad anti-angiogénica de las formas truncadas de manera N-terminal de VEGI-₁₇₄. La proteína VEGI-₁₇₄ exhibió un 20-30% de homología de secuencias respecto de TNFa, TNFß humanos, y el ligando Fas. Se produjo una proteína con un peso molecular de 22 kD en un experimento de transcripción y traducción in vitro mediante el uso de un clon de cADN como molde, coherente con el marco de lectura abierto predicho de 174 aminoácidos. Esta proteína se denomina en la presente memoria VEGI-₁₇₄. El análisis de hidrofobicidad de la proteína predijo una región hidrófoba de 12 aminoácidos inmediatamente después del segmento N-terminal de 14 aminoácidos no hidrófobos. Esto fue coherente con la estructura de una proteína transmembrana de tipo II, similar a los TNFs (B. B. Aggarwal y K. Natarajan (1996) Eur. Cytokine News. 7:93). También se describió una isoforma de VEGI. Esta proteína se denomina en la presente memoria VEGI-₂₅₁, que se predijo que era una proteína de membrana.

Un análisis de Northern reciente de preparaciones de ARN total de 22 tipos diferentes de células cultivadas de diversos linajes indicó que los transcritos de esta proteína solamente se pueden detectar en dos líneas de células endoteliales: las células HUVE y las células endoteliales venosas humanas de un pase temprano. No se detectó un mARN en células endoteliales venosas humanas de un pase posterior, ni se observó en células arteriales humanas. En claro contraste, los miembros...

1. Un polinucleótido aislado que comprende: (a) la secuencia de SEQ ID NO: 1; (b) una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 4 o (c) un complemento de lo anterior.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1.

3. El polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho polinucleótido comprende además un marcador detectable.

4. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho polinucleótido está inmovilizado en una superficie.

5. El polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene la actividad biológica de anti-angiogénesis.

6. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho polinucleótido codifica una proteína de fusión que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 4.

7. Un vector que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 5 ó 6.

8. El vector de la reivindicación 7, en el que el vector es un vector de expresión.

9. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 7 ó 8.

10. Una composición farmacéutica que comprende un polinucleótido según la reivindicación 5 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

11. Un polipéptido aislado que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 4.

12. El polipéptido de la reivindicación 13, en el que el polipéptido consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 4.

13. Un polipéptido aislado que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 4.

14. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 11, 12 ó 13, en el que el polipéptido inhibe el crecimiento de las células endoteliales vasculares.

15. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 11, 12 ó 13, en el que el polipéptido tiene actividad de inhibición de la angiogénesis.

16. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 11, 12 ó 13.

17. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la reivindicación 15 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

18. Un anticuerpo que se une de manera selectiva al polipéptido de SEQ ID NO: 4, pero que no se une a VEGI-₁₇₄, VEGI-_192b o VEGI-₂₅₁.

19. Una composición según la reivindicación 17 para el uso en la inhibición de la angiogénesis.

20. Una composición según la reivindicación 17 para el uso en la inhibición del crecimiento tumoral.

21. Un método in vitro para ensayar un agente o un fármaco en función de la actividad inhibidora angiogénica, y dicho método comprende medir la capacidad de dicho agente o fármaco de incrementar la actividad anti-angiogénica del polipéptido de la reivindicación 11.

22. Un método para ensayar un agente o un fármaco en función de la estimulación de la angiogénesis, y dicho método comprende medir la capacidad de dicho agente o fármaco de reducir o eliminar la actividad anti-angiogénica del polipéptido de la reivindicación 11.

23. Un método para la detección de VEGI-_192a que comprende poner en contacto una muestra de un individuo con un anticuerpo que se une de manera selectiva al polipéptido de la reivindicación 11; y detectar la presencia o ausencia de un complejo formado entre un polipéptido de la muestra y el anticuerpo.

24. Un método para la detección de un polinucleótido de VEGI-_192a que comprende poner en contacto una muestra de un individuo con un oligonucleótido que se une de manera selectiva al polinucleótido de la reivindicación 1; y detectar la presencia o ausencia de una molécula bicatenaria formada entre el oligonucleótido y un polinucleótido de la muestra.