Una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NOS.

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 1

CD154 quimérico.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a los campos de bioquímica, inmunología, ingeniería genética, y medicina. En particular, se refiere a ligandos quiméricos novedosos que, cuando se expresan sobre la superficie de una célula, son más estables que el correspondiente ligandos nativo pero que retiene la función de unión al receptor del ligando nativo y no son inmunogénicos.

Antecedentes de la invención

El sistema inmune elimina las células malignas reconociéndolas como extrañas y después eliminándolas del cuerpo. Para llevar a cabo esto, el sistema inmune induce tanto una respuesta de anticuerpo como una respuesta celular. Estas respuestas requieren la interacción entre un número de células diferentes del sistema inmune (Abbas, Cellular and Molecular Immunology, 2000).

Una reacción inmune típicamente comienza con un linfocito T (célula T) que tiene sobre su superficie un receptor de células T (TCR) que se une a un péptido derivado de antígeno asociado a una molécula de complejo de histocompatibilidad principal de la clase II (MHC). La Célula T también expresa sobre su superficie diversos polipéptidos, que se denominan "ligandos" debido a que se unen a receptores sobre las células asociadas con una respuesta mediada inmune, como se describe en más detalle más adelante. Cuando el receptor de células T se une a un antígeno asociado a MHC, tal como un antígeno derivado de una célula maligna, se llega a activar y expresa un ligando sobre su superficie. El ligando se presenta solamente sobre la superficie de la célula durante un tiempo corto, y una vez que se ha eliminado de la superficie de la célula, la capacidad de las células T para unirse a una célula que lleva un receptor se pierde. Uno de tales ligandos se llama CD154.

CD154 es un miembro de una familia mayor de ligandos, denominados de manera colectiva como la superfamilia TNF (Gruss et al, Cytokines Mol Ther, 1: 75-105, 1995 y Locksley et al, Cell, 104: 487-501, 2001). Los miembros de la superfamilia TNF incluyen ligando Fas ("FasL"), TNFa, LTa, linfotoxina (TNFß), CD154, TRAIL, CD70, ligando CD30, ligando 4-1BB, APRIL, TWEAK, ligando RANK, LIGHT, ligando AITR, ectodisplasina, BLYS, VEGI, y ligando OX40. Los miembros de la superfamilia de TNF comparten una estructura secundaria conservada que comprende cuatro dominios: dominio I, el dominio intracelular; dominio II, que se extiende sobre la membrana celular y se conoce como el dominio transmembrana; dominio III, que consta de los aminoácidos extracelulares próximos a la membrana celular; y el dominio IV, el dominio extracelular distal (Kipps et al., documento WO98/26061 publicado el 18 de junio de 1998). Típicamente, al menos una parte del dominio IV se puede escindir a partir de la molécula precursora. El fragmento escindido a menudo muestra la misma actividad biológica del ligando intacto y se denomina de manera conveniente como una "forma soluble" del miembro de la familia de TNF.

I) Actividad biológica de CD154

Las interacciones entre CD154 (también conocido como ligando CD40) y su receptor afín, CD40, son críticas para el reconocimiento inmune. (Banchereau J. et al., Annu. Rev. Immunol. 12: 881-922, 1994; Laman J.D. et al., Crit. Rev. Immunol., 16: 59-108, 1996). CD154 se expresa de manera transitoria sobre células CD4⁺ T después del acoplamiento del Receptor de células T mediante células que presentan antígeno a través de las moléculas de clase II de MHC. (Roy M. et al., J. Immunol., 151: 2497-2510, 1993; Hepmann P. et al., Eur. J. Immunol., 23: 961-964, 1993; Castle B.E. et al., J. Immunol., 151: 1777-1788, 1993; Cantwell M. et al., Nat. Med., 3: 984-989, 1997). Esto, a su vez, puede provocar la actividad de células que presentan antígeno (APC) que expresan CD40, incluyendo células B, células dendríticas, monocitos, y macrófagos. (Ranheim E.A. et al., J. Exp. Med., 177: 925-935, 1993; Ranheim E.A. et al., Cell. Immunol., 161: 226-235, 1995). Tales células activadas por CD40 pueden comenzar una cascada de episodios activadores inmunes que conducen a una respuesta inmune específica e inmune contra antígenos extraños, tales como virus o tumores. La importancia de las interacciones entre CD40 y CD154 se subraya por el hallazgo de los individuos que han heredado defectos en el ligando para CD40 que tienen deficiencia inmune profunda. (Korthauer J. et al., Nature, 361: 539-541, 1993; Aruffo A. et al., Cell., 72: 291-300, 1993). Tales pacientes tienen un síndrome de deficiencia inmune asociado a la formación del centro germinal alterada, intercambio del isotipo defectuosa, y susceptibilidad marcada a diversos patógenos bacterianos y virales.

Debido a que CD154 es tal molécula crítica en la regulación inmune, varios mecanismos controlan la expresión de CD154 humano. Primero, CD154 expresado en membrana se puede escindir y una parte extracelular de capaz de unirse al receptor CD154, CD40, se libera como una molécula soluble. Las enzimas de escisión proteolíticas se ha mostrado que escinden CD154 humano en diferentes sitios a lo largo del ligando, y libera una forma a soluble de CD154 que es capaz de unirse a CD40 y estimular una respuesta inmune. (Pietravalle F. et al., J. Biol. Chem., 271: 5965-5967, 1996; Pietravalle F. et al., Eur. J. Immunol., 26: 725-728, 1996). Por ejemplo, un estudio ha mostrado que CD154 se escinde entre Phe 111 y Ala 123 (Pietravalle F. et al., Eur. J. Immunol., 26: 725-728, 1996), y la escisión también se ha reseñado en Met 113. Segundo, la interacción de CD154 con su receptor afín puede inducir una modulación hacia abajo rápida de la expresión en la superficie de CD154. (Cantwell M. et al., Nat. Med., 3: 984-989, 1997). Tercero, la transcripción del gen de CD154 está regulada fuertemente con la expresión máxima de ligandos 4 a 6 horas después del ligamiento de TCR seguido de una rápida disminución de síntesis de ARN ARN y proteína de CD154. (Id.) Conjuntamente, estos mecanismos reguladores aseguran la especificidad la especificidad de una respuesta inmune a un antígeno específico. La importancia de mantener un fuerte control de la expresión de CD154 se manifiesta en individuos con lupus sistémico eritematoso (SLE). Estos pacientes parece que hiperexpresan CD154 así como que poseen niveles elevados de CD154 soluble en su plasma, que sugiere que la expresión de CD154 no controlada contribuye a una actividad de la enfermedad de SLE. (Kato K. et al., J. Clin. Invest., 101: 1133-1141, 1998; Vakkalanka R.K., Arthritis Rheum., 42: 871-881, 1999).

El potencial para uso de CD154 para inmunoterapia está bajo investigación activa. Debido a que CD154 es un potente activador inmune, CD154 como una terapia de cáncer es un foco principal de investigación de debido a que las células neoplásicas son pobres presentadores de antígenos e incapaces de estimular respuestas vigorosas antitumorales. Por ejemplo, leucemia linfocítica crónica (CLL) las células B modificadas para expresar CD154 usando un vector de adenovirus defectuoso de replicación puede potenciar la presentación de antígeno de CLL e inducir la citotoxicidad de células T antólogas hacia células B de CLL no modificadas. (Kato K. et al., J. Clin. Invest., 101: 1133-1141, 1998). Además, un estudio de fase I clínico que usa células B de CLL modificadas por Ad-CD154 mostró resultados terapéuticos prometedores. (Wierda W.G: et al., Blood, 96: 2917-2924, 2000). De manera similar, otros estudios mostraron que la modificación de una gama de tipos de tumores que expresan CD154 puede inducir respuestas inmunes antitumorales eficaces en modelos animales.

Los estudios de manipulación de Células B y otros tumores trabajan mediante o bien la potenciación de la presentación de antígeno de la propia célula neoplásica, como es el caso para CLL y linfoma de células B, o mediante activación de las células que presentan antígeno espectadoras, tales como células dendríticas que pueden iniciar una respuesta inmune antitumoral, como es el caso para tumores negativos a CD40. Sin embargo, estudios adicionales también sugieren que CD154 puede tener un efecto inhibidor de crecimiento directo sobre ciertos tumores, especialmente carcinomas de mama. (Tong A.W. et al., Clin. Cancer Des., 7: 691-703, 2001; Hirano A., Blood, 93: 2999-3007, 1999). Además, existe evidencia que el crecimiento de algunos tipos de linfoma se puede inhibir directamente por la ligación a CD40. (Wilsey J.A. et al., J. Immunol., 158: 2932-2938, 1997). Como tal, una amplia gama de tumores debe ser...

1. Una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NOS. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que molécula de ácido nucleico tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NOS. 2, 4, 6, 8, 10 y 12.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que molécula de ácido nucleico tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NOS. 14, 16, 18, 20, 22, y 24.

4. Un vector de expresión, que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

5. El vector de expresión de la reivindicación 4, que comprende además ADN viral o ADN bacteriano.

6. El vector de expresión de la reivindicación 5, en el que dicho ADN viral se selecciona entre el grupo constituido por ADN adenoviral y ADN retroviral.

7. El vector de expresión de la reivindicación 6, en el que al menos una parte del vector comprende ADN adenoviral.

8. Una construcción genética que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 unida de manera operativa a una secuencia de promotor y a una secuencia de señal de poliadenilación.

9. Una célula huésped, que comprende un vector de expresión de la reivindicación 4 o una construcción genética de la reivindicación 8.

10. La célula huésped de la reivindicación 9, en la que la célula es una célula CD40⁺ humana.

11. La célula huésped de la reivindicación 9, en la que la célula es una célula tumoral.

12. La célula huésped de la reivindicación 9, en la que la célula es una célula que presenta antígeno.

13. La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en la que la célula es una célula B.

14. Un polipéptido de CD154 quimérico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NOS. 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 y 29.

15. Un procedimiento para producir un CD154 quimérico de la reivindicación 14, que comprende cultivar una célula huésped de la reivindicación 9 en condiciones adecuadas para efectuar la expresión de la proteína.

16. Uso de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de CD154 quimérico de acuerdo con reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para inducir la activación de una célula del sistema inmune, en el que CD154 quimérico se expresa sobre la superficie de la célula.

17. Uso de acuerdo con reivindicación 16, en el que la célula es una célula CD40⁺ humana.