NUEVAS SECUENCIAS DE POLINUCLEÓTIDOS Y POLIPÉPTIDOS Y SUS USOS.
Un oligonucleótido antisentido aislado, en el que dicho oligonucleótido inhibe la expresión del polinucleótido de la SEQ ID NO:
1 o SEQ ID NO:3, en el que el oligonucleótido consiste en 20-30 o 12-25 nucleótidos de la región codificadora de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 o el complemento de esta
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2003/020601.
Solicitante: IMCLONE LLC.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 180 VARICK STREET NEW YORK, NY 10014 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.
Inventor/es: PEREIRA,DANIEL.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 30 de Junio de 2003.
Fecha Concesión Europea: 29 de Septiembre de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K14/705B
Clasificación PCT:
- A01N43/04 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA. › A01N CONSERVACION DE CUERPOS HUMANOS O ANIMALES O DE VEGETALES O DE PARTES DE ELLOS (conservación de alimentos o productos alimenticios A23 ); BIOCIDAS, p. ej. EN TANTO QUE SEAN DESINFECTANTES, PESTICIDAS O HERBICIDAS (preparaciones de uso médico, dental o para el aseo que eliminan o previenen el crecimiento o la proliferación de organismos no deseados A61K ); PRODUCTOS QUE ATRAEN O REPELEN A LOS ANIMALES; REGULADORES DEL CRECIMIENTO DE LOS VEGETALES. › A01N 43/00 Biocidas, productos que atraen o repelen a los animales perjudiciales, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen compuestos heterocíclicos (que contienen anhídridos cíclicos, imidas cíclicas A01N 37/00; que contienen compuestos de fórmula , que no tienen más que un heterociclo en los que m≥1 y n≥0 y es una pirrolidina, una piperidina, una morfolina, una tiomorfolina, una piperazina o una polimetilenoimina, no sustituida o sustituida por un alcoilo, que tiene al menos cuatro grupos CH 2 A01N 33/00 - A01N 41/12; que contienen ácidos ciclopropanocarbhoxílicos o sus derivados, p. ej. ésteres con heterociclos, A01N 53/00). › con un heteroátomo.
- A61K31/07 A […] › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 31/00 Preparaciones medicinales que contienen ingredientes orgánicos activos. › Compuestos del retinol, p. ej. la vitamina A (ácidos retinoicos A61K 31/203).
- C07H21/04 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con desoxirribosilo como radical sacárido.
- C12Q1/68 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Clasificación antigua:
- C12N1/00 C12 […] › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo.
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.
Fragmento de la descripción:
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a polinucleótidos y polipéptidos que se expresan en forma diferencial en una célula enferma y los procedimientos de diagnóstico, evaluación, tratamiento y prevención de enfermedades relacionadas con estos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El cáncer es la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos, sólo superada por la enfermedad cardíaca. En 2002, la American Cancer Society estimó que se diagnosticarán 1.284.900 nuevos casos y se espera que 550.000 de los 1,6 millones que viven con cáncer mueran. El cáncer es causado por la alteración genética o mal funcionamiento de los genes en la célula que origina la proliferación descontrolada de las células anormales para formar una masa o neoplasia tumoral. Uno de los principales contribuyentes a la proliferación descontrolada de las células es la sobreexpresión de los protooncogenes y/o subexpresión de los genes supresores del tumor. Ambos genes cumplen un papel crítico en la patogénesis del cáncer y el desbalance de la expresión del polinucleótido de estas dos familias de polinucleótidos perpetúa la inmortalización del cáncer. Las clases de oncogenes y genes y polipéptidos supresores del tumor incluyen los factores de crecimiento, tales como factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento transformante α (TNF-α) y sus correspondientes receptores, polipéptidos de señalización intracelular (tirosina quinasas), factores de transcripción de polinucleótidos, polipéptidos de control del ciclo celular, y polipéptidos de interacción célula-célula o célula-matriz.
El crecimiento celular descontrolado lleva a la formación de una masa celular tumoral localizada, cuya viabilidad se mantiene por la formación de neovasculatura tal como capilares sanguíneos que son esenciales para transportar los nutrientes a las células. La angiogénesis es en consecuencia un elemento clave en la supervivencia, crecimiento y metástasis de los tumores. Los polipéptidos conocidos por cumplir un papel vital en la angiogénesis son los factores de crecimiento y sus correspondientes receptores, que incluyen EGF y TGF-α, así como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).
La masa tumoral localizada, con su proliferación celular rápida y continua, finalmente produce la invasión de los tejidos adyacentes ya que las células tumorales se escapan de la masa tumoral original y migran a los ganglios linfáticos regionales y estructuras vitales distales en el cuerpo por medio de los sistemas sanguíneos o linfáticos. La invasión de las células tumorales requiere la adhesión de las células a la matriz extracelular, seguida por su ruptura y finalmente la migración de la célula tumoral. Se ha mostrado la diseminación de ciertos cánceres en los sitios preferidos por la presencia de ciertos polipéptidos en la superficie celular que son capaces de concentrar marcadores de superficie celular seleccionados en las células diana.
En consecuencia, la inhibición de la proliferación celular descontrolada, angiogénesis, y difusión celular son algunos de las dianas clave en el desarrollo de agentes terapéuticos para tratar la progresión y recurrencia tumoral. Si bien se ha realizado mucho avance en el campo del cáncer y terapia del cáncer, muchas de las terapias en desarrollo actuales han sido poco satisfactorias, y existe la necesidad de una terapia adyuvante alternativa para muchos de estos tipos de tumores específicos. La presente solicitud involucra el descubrimiento de un nuevo polinucleótido que codifica un polipéptido o polipéptido que se expresa en forma diferencial en ciertas células tumorales y puede ser útil en el diagnóstico, evaluación, tratamiento y prevención del cáncer.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona un oligonucleótido antisentido aislado, en el que dicho oligonucleótido inhibe la expresión del polinucleótido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:3, en el que el oligonucleótido está constituido de 20-30 o 12-25 nucleótidos de la región codificadora de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:3 o el complemento de esta.
Se proporcionan polinucleótidos de S30-21616/DEGA humanos y murinos aislados y/o purificados (hS30-21616/DEGA o mS30-21616/DEGA respectivamente), en particular SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, o un fragmento de estos. Se describen los polipéptidos de S3021616/DEGA humanos y murinos aislados y/o purificados (hS30-21616/DEGA y mS3021616/DEGA), en particular SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, o un fragmentos de estos. Además, se proporcionan procedimientos y composiciones para el diagnóstico, evaluación, tratamiento y prevención de enfermedades usando tales polinucleótidos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 ilustra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos deducidos de S3021616/DEGA (ADNc = 3769 pb; ORF = 1569 pb, que codifica un polipéptido de 522 aminoácidos) con las siguientes características: secuencia del péptido señal (negrita); dominio de transmembrana (negrita subrayada); sitios de glicosilación positivos (aminoácidos rodeados) y serinas y treoninas fosforiladas putativas (aminoácidos recuadrados)
Las Figuras 2 A y B muestran el análisis de transferencia de punto de los niveles de expresión de ADNc de S30-21616/ DEGA en muestras de tejido tumoral y normal de los pacientes individuales usando Matrices de Perfil del Cáncer BD Biosciences I (A) y II (B).
La Figura 3 muestra el análisis de transferencia Northern de la expresión de S3021616/DEGA en líneas celulares de adenocarcinoma gástrico, AGS (calle A), NCI-N87 (calle B), RF-1 (calle C), KatoIII (calle D), KKVR (calle E), NCI-SNU-16 (calle F), y NCI-SNU-1 (calle G). El panel inferior muestra el nivel de ARNm de β-actina en las líneas celulares respectivas.
La Figura 4 muestra el análisis de transferencia de punto de la expresión de S3021616/DEGA en líneas celulares generales no de adenocarcinoma gástrico.
La Figura 5A muestra la representación esquemática de la proteína de S3021616/DEGA. Los dominios presentes en la proteína de S30-21616/DEGA se muestran con sus límites de aminoácidos siguientes: SP=Péptido señal; LRR=Repetición rica en leucina; LRR-NT=LRR Dominio rico en cisteína flanquante N-terminal; LRR-CT=LRR Dominio rico en cisteína flanqueante C-terminal; IgG=dominio de inmunoglobulina; TM=dominio de transmembrana; y S/T-Rico=Dominio rico en serina/treonina-rico. Los rombos negros representan sitios de glicosilación N-ligados putativos. La Figura 5B muestra la secuencia de aminoácidos del polinucleótido de S30-21616/DEGA con la LRR en negrita, el dominio tipo inmunoglobulina subrayado, el dominio de transmembrana recuadrado, y los sitios de fosforilación de caseína quinasa y de fosforilación de polipéptido quinasa C indicados por [] y (), respectivamente.
La Figura 6 ilustra la localización subcelular de la proteína de fusión S30-21616/DEGAEGFP (Proteína Fluorescente Verde Potenciada) que se expresó en forma estable en células 293 y se evalúa usando microscopia de fluorescencia (aumento 200X).
La Figura 7 muestra la expresión de S30-21616/DEGA por análisis de transferencia Northern en células progenitoras AGS o tipo salvajes (calle 1), AGS transfectadas con el vector vacío, AGS/clon del vector vacío #15 (calle 2), AGS transfectadas con S30-21616/DEGA antisentido, clon AGS/DEGA antisentido #6 (calle 3) y clon antisentido AGS/DEGA #11 (calle 4). El panel inferior muestra la expresión endógena de ARNm de β-actina en los tipos celulares respectivos (control interno).
La Figura 8 (panel izquierdo) muestra los histogramas de citometría de flujo de los perfiles de contenidos de ADN/ ciclo celular del clon del vector vacío AGS #15 (panel izquierdo superior), clon antisentido AGS/DEGA #6 (panel izquierdo medio) y clon antisentido AGS/DEGA #11 (panel izquierdo inferior). La Figura 8 (panel derecho) muestra la microscopía óptica que compara el tamaño celular del clon antisentido AGS #6 (panel derecho medio) y clon #11 (panel derecho inferior) al AGS/clon del vector vacío #15 (panel derecho superior).
La Figura 9 ilustra las curvas de crecimiento tumorigénico de los clones de AGS transfectados en forma estable con constructo de DEGA antisentido o vector vacío determinado por la cantidad de ratones portadores del tumor versus la cantidad total de ratones inyectados, de la siguiente manera: AGS WT (12/12); AGS/clon del vector vacío #15 (19/19); clon antisentido AGS/DEGA #6 (6/12); y clon antisentido AGS/DEGA #11 (6/19).
DESCRIPCIÓN...
Reivindicaciones:
1. Un oligonucleótido antisentido aislado, en el que dicho oligonucleótido inhibe la expresión del polinucleótido de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, en el que el oligonucleótido consiste en 20-30 o 12-25 nucleótidos de la región codificadora de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 o el complemento de esta.
2. Un oligonucleótido antisentido aislado de la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido está en forma de ADN bicatenario, ADN monocatenario, ARN o una combinación de estos.
3. Un oligonucleótido antisentido aislado de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el ADN monocatenario es una cadena codificadora o una cadena no codificadora.
4. Un oligonucleótido antisentido aislado de cualquier reivindicación precedente, en el que las uniones fosfodiéster del oligonucleótido están modificadas.
5. Un procedimiento in vitro de inhibición de la expresión del polipéptido de la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4 que comprende introducir el oligonucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en una célula, en el que el oligonucleótido inhibe la expresión del polinucleótido de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el oligonucleótido se administra en una célula por un procedimiento seleccionado del grupo constituido por: endocitosis mediada por receptor; microinyección; por medio de complejos ADN-proteína; y encapsulación liposómica catiónica.
7. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que un ligando del receptor o anticuerpos específicos de la célula asisten en la conducción del oligonucleótido a la célula.
8. Uso de un oligonucleótido antisentido aislado, en el que dicho oligonucleótido inhibe la expresión del polinucleótido de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, para la fabricación de un medicamento para tratar adenocarcinoma gástrico.
9. Uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el oligonucleótido está en forma de un ADN bicatenario, ADN monocatenario, ARN o una combinación de estos.
10. Uso de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, en el que el ADN monocatenario es una cadena codificadora, una cadena no codificadora o una combinación de estas.
11. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que el oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, un complemento de esta, un fragmento de esta o un ORF de esta.
12. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que el oligonucleótido comprende 20-30 o 12-25 nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3.
13. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el que las uniones fosfodiéster del oligonucleótido están modificadas.
14. Un oligonucleótido antisentido aislado como se define en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, para tratar el adenocarcinoma gástrico.
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