Un anticuerpo purificado, o un fragmento del mismo, el cual se une específicamente a un dominio extracelular del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos FGFR-1(IIIc) y FGFR-4(IIIc),

y neutraliza la activación del receptor, en el que el anticuerpo comprende seis regiones determinantes de complementariedad (CDRs) SEC ID NO:9 (VHCDR1), SEC ID NO:10 (VHCDR2), SEC ID NO:11 (VHCDR3), SEC ID NO:12 (VLCDR1), SEC ID NO:13 (VLCDR2) y SEC ID NO:14 (VLCDR3)

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un anticuerpo, o fragmento del mismo, que es específico para el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos FGFR-1(IIIc) y FGFR-4(IIIc). La presente invención proporciona además procedimientos de antagonización y neutralización del FGFR-1 y FGFR-4 como un tratamiento para la obesidad, diabetes, y/o un estado relacionado con las mismas, que incluye la reducción de la ingesta de alimentos o de la masa corporal total.

Antecedentes de la invención

Las vías del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) están en general implicadas en muchos procesos fisiológicos, tales como la morfogénesis durante el desarrollo y la angiogénesis que es el proceso de desarrollo de nuevos vasos sanguíneos que implica la proliferación, migración, e infiltración de tejidos de células endoteliales capilares a partir de vasos sanguíneos pre-existentes. Los FGFs son algunos de los factores que han sido implicados como posibles reguladores de la angiogénesis conjuntamente con el factor de crecimiento de transformación (TGF), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), y el factor de crecimiento obtenido de plaquetas (PDGF). Igualmente, las vías del FGF están implicadas en la supervivencia neuronal y la curación de heridas. Igualmente, se estima que son importantes en un cierto número de procesos patológicos.

En particular, el FGFR-1 se le ha implicado como involucrado en enfermedades tales como cánceres y artritis. Aunque se ha sugerido la implicación de las vías del FGF en el metabolismo, tal como el comportamiento alimentario y desarrollo de tejido adiposo, no está claro si estos hallazgos implican mecanismos fundamentales a través de los cuales se regula el metabolismo. Por ejemplo, un reciente estudio realizado en ratones ha mostrado que inyecciones del FGF-2, en combinación con proteínas de membranas basales, puede inducir el desarrollo de nuevo tejido adiposo en el sitio de la inyección. Esto sugiere que los FGFs producidos localmente pueden actuar de una manera paracrina para afectar a la adipogénesis y, en consecuencia, influir en la distribución regional de tejido adiposo en el cuerpo y en la relación entre tejido adiposo y resistencia a la insulina está bien establecida, estando ambas fuertemente implicadas en la diabetes tipo 2 y la enfermedad cardiovascular.

Los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFRs) tienen características estructurales comunes y están constituidos por un dominio de unión de ligando extracelular que contiene 2 ó 3 hélices tipo Ig y una única región ácido, un dominio trans-membrana, y la región citoplásmica, la cual contiene el dominio catalítico tirosina quinasa y el inserto quinasa. Los FGFRs pertenecen a la Subclase IV del receptor tirosina quinasa de la familia de proteínas. Estos receptores se unen de acuerdo con un patrón de solapamiento con los FGFs. Se ha establecido que 22 FGFs actúan sobre 5 FGFRs en interacción paracrina de ligando del FGF.

El FGFR-1 tiene dos formas de corte y empalme alternativas que difieren entre sí por las substituciones de aminoácidos en el tercer dominio tipo IgG de la estructura extracelular del receptor designado IIIb y IIIc. El FGFR-4 tiene solamente una. Estas substituciones constituyen lo que se estima que es parte del dominio de unión del receptor y, en consecuencia, son lo más probablemente la causa de que las dos formas de corte y empalme tengan distintas especificidades de ligandos. Igualmente, se ha mostrado que las dos formas están expresadas de manera diferencial, lo cual puede ser parte de un mecanismo de control exquisito de funciones complejas mediadas por el FGFR-1.

La unión de ligandos, la cual está fortalecida por la presencia de sulfato de heparina, da lugar a que los FGFRs se dimericen y activen vías de señalas intracelulares específicas (Bellot y otros, 1991). El receptor se transforma en auto-fosforilado y, de esta forma, es capaz de activar vías celulares más abajo. Entre diferentes respuestas celulares, la estimulación de la proliferación o la inducción de diferenciación son las más comúnmente observadas para señales mediadas por el FGFR-1.

En la técnica se conocen diversos anticuerpos que unen y neutralizan la activación del receptor FGFR-1 (Patente WO 02/102973; Prochon Biotech Ltd.) (Blanckaert y otros “Partial characterization of endotelial FGF receptor functional domain by monoclonal antibody VBS-1”, Hybridoma and Hybridomics, vol. 21, nº. 3, págs. 153-159, (2002)).

Sumario de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos, o fragmentos de los mismos, específicos para el receptor del factor de crecimiento de fibloblastos FGFR-1(IIIc) y FGFR-4(IIIc), así como ácidos nucleicos que codifican estos anticuerpos o fragmentos de los mismos. Igualmente, se proporcionan vectores que comprenden dichos ácidos nucleicos y células huéspedes para la producción de estos anticuerpos.

La presente invención proporciona además un uso de un antagonista del FGFR-1(IIIc) y FGF-4(IIIc) en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la obesidad, un estado resultante de o agravado por la obesidad, diabetes, o un estado resultante de o agravado por la diabetes, en la que el antagonista es un anticuerpo de la invención o fragmento del mismo.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de las regiones variables y las CDRs del FR1-H7. La Figura 1A muestra las secuencias de aminoácidos y de ADN de la región variable de la cadena pesada del FR1-H7 (SEC ID NOS: 7 y 31). La Figura 1B muestra las secuencias de aminoácidos y de ADN de la región variable de la cadena ligera del FR1-H7 (SEC ID NOS: 8 y 32). La Figura 1C muestra las secuencias de ácidos nucleicos de las CDRs de la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera del FR1-H7 (SEC ID NOS: 25-30). La Figura 1D muestra las secuencias de aminoácidos de las CDRs de la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera del FR1-H7 (SEC ID NOS: 1-6).

La Figura 2 muestra las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de las regiones variables del FR1-A1. La Figura 2A muestra las secuencias de aminoácidos y de ADN de la región variable de la cadena pesada del FR1-A1 (SEC ID NOS: 15 y 39). La Figura 2B muestra las secuencias de aminoácidos y de ADN de la región variable de la cadena ligera del FR1-A1 (SEC ID NOS: 16 y 40). La Figura 2C muestra las secuencias de ácidos nucleicos de las CDRs de la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera del FR1-A1 (SEC ID NOS: 33-38). La Figura 2D muestra las secuencias de aminoácidos de las CDRs de la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera del FR1-A1 (SEC ID NOS: 9-14).

La Figura 3 muestra la unión del anticuerpo FR1-H7 a FGFRs determinada usando el ensayo de unión ELISA. Cada punto de datos es un promedio de valores duplicados y las barras de error son desviaciones estándar.

La Figura 4 muestra la unión del FGFR1-1 recombinante al ligando FGF determinada usando el ensayo de bloqueo ELISA. La Figura 4A muestra la unión al FGF-1 inmovilizado y la Figura 4B muestra la unión al FGF-2 inmovilizado. Cada punto de datos es un promedio de valores duplicados y las barras de error son desviaciones estándar.

La Figura 5 muestra la unión del 125I-FGF-2 al FGFR-1 de superficie de célula. En la Figura 5A, la unión del 125I-FGF2 a las células tiene dos componentes distintos: uniones no específicas y específicas. En la Figura 5B, la unión 125IFGF-2 a las células fue inhibida por la presencia del anticuerpo FR1-H7. Cada punto de datos es un promedio de valores triplicados. Las barras de error son desviaciones estándar.

La Figura 6 muestra una transferencia Western de fosforilación del FGFR-1. La mancha superior se ensayó con anticuerpo anti-fosfo-tirosina y la mancha inferior muestra bandas de proteína de control en los lisatos de células para estimación de la carga relativa de gel.

La Figura 7 muestra la proliferación de células endoteliales vasculares umbilicales humanas (HUVECs) in vitro en presencia de anticuerpos. Cada punto de datos es un promedio de valores triplicados y las barras de error son desviaciones estándar.

La Figura 8 muestra la proliferación de adipocitos in vitro. La Figura 8A muestra los efectos del FGF-2 sobre la proliferacion de adipocitos y la Figura 8B muestra... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo purificado, o un fragmento del mismo, el cual se une específicamente a un dominio extracelular del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos FGFR-1(IIIc) y FGFR-4(IIIc), y neutraliza la activación del receptor, en el que el anticuerpo comprende seis regiones determinantes de complementariedad (CDRs) SEC ID NO:9 (VHCDR1), SEC ID NO:10 (VHCDR2), SEC ID NO:11 (VHCDR3), SEC ID NO:12 (VLCDR1), SEC ID NO:13 (VLCDR2) y SEC ID NO:14 (VLCDR3).

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo, o fragmento del mismo, inhibe la unión de un ligando del FGFR-1(IIIc) o FGFR-4(IIIc) a su receptor.

3. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el anticuerpo comprende al menos una secuencia de región variable de cadena pesada de la SEC ID NO:15 o una secuencia de región variable de cadena ligera de la SEC ID NO:16.

4. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el anticuerpo comprende al menos una secuencia de región variable de cadena pesada de la SEC ID NO:15 y una secuencia de región variable de cadena ligera de la SEC ID NO:16.

5. Un ácido nucléico aislado que codifica el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Un vector de expresión que comprende el ácido nucléico de la reivindicación 5, ligado de manera operable a una secuencia de control.

7. Una célula huésped aislada que comprende el vector de expresión de la reivindicación 6.

8. Un procedimiento de producción de un anticuerpo que comprende el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 7, bajo condiciones que permiten la expresión del anticuerpo.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el procedimiento comprende además la purificación del anticuerpo.

10. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y un vehículo aceptable farmacéuticamente.

11. Uso de un antagonista del FGFR-1(IIIc) y FGFR-4(IIIc) en la preparación de un medicamento para el tratamiento

o la prevención de la obesidad, un estado resultante de o agravado por la obesidad, diabetes, o un estado resultante de o agravado por la diabetes, en el que el antagonista es un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el estado es hipertensión o una enfermedad cardiovascular.

Fig. 1A. Secuencia de ADN y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del FR1-H7 Secuencia de la región variable de la cadena pesada (ADNc)

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Secuencia de la región variable de la cadena pesada (aminoácido)

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Fig. 1B. Secuencia de ADN y aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del FR1-H7

Secuencia de la región variable de la cadena ligera (ADNc)

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Secuencia de la región variable de la cadena ligera (aminoácido)

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Fig. 1C. CDRs para secuencias de ácido nucleico de FR1-H7

VH (Subclase I de la cadena pesada humana) CDR1 GACTTACTACATGCAC CDR2 CTTGTTGATCCTGAAGATGGTGAAACAATCTACGCAGAGAAGTTCCAGGGC CDR3 GATGACTACATGGACGTC

Vl (Subgrupo III de la cadena ligera kappa humana) CDR1 AGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCGGCAGTGCGTTGGCC CDR2 GATGCATCCAGTAGGGCCACT CDR3 CAGCAATATGGTAGCTCACCTCTCACT Fig. 1D. CDRs para secuencias de aminoácido de FR1-H7

VH (Subclase I de la cadena pesada humana) CDR 1 DYYMH CDR2 LVDPEDGETIYEKFQG CDR3 DDYMDV

VL (Subgrupo III de la cadena ligera kappa humana) CDR1 RASQSVSGSALA CDR2 DASSRAT CDR3 QQYGSSPLT

Fig. 2A. Secuencia de ADN y de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del FR1A1

Secuencia de la región variable de la cadena pesada (ADNc)

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Secuencia de la región variable de la cadena pesada (aminoácido)

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Fig. 2B. Secuencia de ADN y de aminoácido de la cadena ligera del FR1-A Secuencia de la región variable de la cadena ligera (ADNc)

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Secuencia de la región variable de la cadena ligera (aminoácido)

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Figura 2C. CDRs para secuencias de ácido nucléico del FR1-A1

VH (Subclase I de la cadena pesada humana) CDR1 GGCTACTATATGCAC CDR2 AGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGC CDR3 GGAGGAGATCTGGGCGGTATGGACGTC

VL (Subgrupo II de la cadena ligera kappa humana) CDR1 AGGTCTAGTCAGAGCCTCCGGCATAGTAATGGATACAACTATTTGGAT CDR2 TTGGCTTCTAATCGGGCCTCC CDR3 ATGCAAGCTCTACAAATTCCTCCGACT Figura 2D. CDRs para secuencias de aminoácidos del FR1-A1

VH Subclase I de la cadena pesada humana) CDR1 GYYMH CDR2 RIIPILGIANYAQKFQG CDR3 GGDLGGMDV

VL (Subgrupo II de la cadena ligera kappa humana) CDR1 RSSQSLRHSNGYNYLD CDR2 LASNRAS CDR3 MQALQIPPT