Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une selectivamente al receptor que contiene el dominio de inserto quinasa (KDR) humano,

en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende regiones determinantes de complementariedad representadas por la SEC ID Nº: 81 en la CDRL1; la SEC ID Nº: 82 en la CDRL2; la SEC ID Nº: 83 en la CDRL3; la SEC ID Nº: 13 en la CDRH1; la SEC ID Nº: 14 en la CDRH2; y la SEC ID Nº: 15 en la CDRH3

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos humanos que se unen a KDR, que bloquean la unión de KDR al receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) y que neutralizan la activación de KDR. Los anticuerpos se usan para tratar enfermedades neoplásicas y trastornos hiperproliferativos, y pueden usarse en solitario o en combinación con otros antagonistas de VEGFR, y con antagonistas del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR).

Antecedentes de la invención

La angiogénesis es un proceso altamente complejo de desarrollo de nuevos vasos sanguíneos que implica la proliferación y migración de, y la infiltración tisular por células endoteliales capilares de vasos sanguíneos preexistentes, el ensamblaje celular en estructuras tubulares, la unión de ensamblajes tubulares de reciente formación a sistemas vasculares de circuito cerrado y la maduración de los vasos capilares recién formados.

La angiogénesis es importante en procesos fisiológicos normales, incluyendo el desarrollo embrionario, el crecimiento folicular y la cicatrización de heridas, así como en afecciones patológicas, tales como el crecimiento de tumores, y en enfermedades no neoplásicas que impliquen una neovascularización anormal, incluyendo glaucoma neovascular (Folkman, J. y Klagsbrun, M., Science, 235: 442-7 (1987). Otras patologías incluyen, pero sin limitación, enfermedades neoplásicas incluyendo, pero sin limitación, tumores sólidos, aterosclerosis y otras enfermedades inflamatorias, tales como artritis reumatoide y afecciones oftalmológicas tales como retinopatía diabética y degeneración macular relacionada con la edad. Las afecciones o enfermedades a las que contribuye una angiogénesis persistente o descontrolada se han denominado enfermedades dependientes de la angiogénesis o asociadas a la angiogénesis.

Un medio para controlar dichas enfermedades y afecciones patológicas comprende restringir el suministro de sangre a aquellas células implicadas en mediar o causar la enfermedad o afección, por ejemplo, ocluyendo los vasos sanguíneos que la suministran a las porciones de los órganos en las que están presentes tumores. Dichas estrategias requieren que se identifique el sitio del tumor y generalmente se limitan al tratamiento en un solo sitio, o en un pequeño número de sitios. Una desventaja adicional de la restricción mecánica directa del suministro sanguíneo es que se desarrollan vasos sanguíneos colaterales, a menudo bastante rápidamente, restaurando el suministro de sangre al tumor.

Otras estrategias se han centrado en la modulación de factores que están implicados en la regulación de la angiogénesis. Aunque normalmente inactiva, la proliferación endotelial vascular está altamente regulada, incluso durante la angiogénesis. El VEGF es un factor que se ha implicado como regulador de la angiogénesis in vivo (Klagsbrun, M. y D'Amore, P., Annual Rev. Physiol., 53: 217-39 (1991)).

Un mitógeno específico de células endoteliales, VEGF, actúa como inductor de la angiogénesis, promoviendo específicamente la proliferación de células endoteliales. Es una glicoproteína homodimérica que consiste en dos subunidades de 23 kD. Se han identificado cuatro isoformas monoméricas diferentes de VEGF resultantes de un corte y empalme alternativo de ARNm. Estas incluyen dos formas unidas a membrana (VEGF206 y VEGF189) y dos formas solubles (VEGF165 y VEGF121). El VEGF165 es la isoforma más abundante en todos los tejidos humanos excepto en la placenta.

El VEGF se expresa en tejidos embrionarios (Breier y col., Development, 114: 521-32 (1992)), macrófagos y queratinocitos epidérmicos en proliferación durante la cicatrización de heridas (Brown y col., J. Exp. Med 176: 13759 (1992)), y puede ser responsable del edema tisular asociado con inflamación (Ferrara y col., Endocr. Rev., 13: 1832 (1992)). Los estudios de hibridación in situ han demostrado altos niveles de expresión de VEGF en varias líneas tumorales humanas, incluyendo glioblastoma multiforme, hemangioblastoma, otras neoplasias del sistema nervioso central y sarcoma de Kaposi asociado con SIDA (Plate, K. y col., Nature, 359: 845-8 (1992); Plate, K. y col., Cancer Res., 53: 5822-7 (1993); Berkman, R. y col., J. Clin. Invest., 91: 153-9 (1993); Nakamura, S. y col., AIDS Weekly, 13

(1) (1992)). También se han encontrado altos niveles de expresión de VEGF en placas y lesiones ateroscleróticas y en células inflamatorias.

El VEGF media su efecto biológico a través de receptores de VEGF de alta afinidad que se expresan de forma selectiva en células endoteliales durante, por ejemplo, la embriogénesis (Millauer, B. y col. Cell, 72: 835-46 (1993)) y la formación de tumores, y que se han implicado en la modulación de la angiogénesis y en el crecimiento de tumores. Estos receptores comprenden un dominio citosólico de tirosina quinasa que inicia la ruta de señalización implicada en el crecimiento celular.

Los receptores de VEGF típicamente son tirosina quinasas de tipo receptor de clase III caracterizadas por tener varios bucles de tipo inmunoglobulina, típicamente 5 ó 7, en sus dominios de unión a ligando de receptor extracelular aminoterminal (Kaipainen y col., J. Exp. Med., 178: 2077-88 (1993)). Las otras dos regiones incluyen una región

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transmembrana y un dominio catalítico intracelular carboxiterminal interrumpido por una inserción de secuencias interquinasa hidrófilas de diversas longitudes, denominada dominio de inserto quinasa (Terman y col., Oncogene, 6: 1677-83 (1991)). Los receptores de VEGF incluyen el receptor tirosina quinasa tipo fms (flt-1), o VEGFR-1, secuenciado por Shibuya y col., Oncogene, 5: 519-24 (1990), el receptor que contiene el dominio de inserto quinasa/quinasa de hígado fetal (KDR/flk-1), o VEGFR-2, descrito en el documento WO 92/14248, presentado el 20 de febrero de 1992 y Terman y col., Oncogene, 6: 1677-83 (1991) y secuenciado por Matthews y col., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 88: 9026-30 (1991), aunque otros receptores también pueden unirse a VEGF. Otro receptor tirosina quinasa, VEGFR-3 (flt-4), se une a los homólogos de VEGF VEGF-C y VEGF-D, y es importante en el desarrollo de vasos linfáticos.

La liberación de VEGF por una masa tumoral estimula la angiogénesis en células endoteliales adyacentes. Cuando el VEGF se expresa por la masa tumoral, las células endoteliales adyacentes a las células tumorales VEGF+ regularán positivamente la expresión de receptores de VEGF, por ejemplo, VEGFR-1 y VEGFR-2. Se cree en general que KDR/VEGFR-2 es el transductor de señales de VEGF principal que da como resultado la proliferación de células endoteliales, migración, diferenciación, formación de tubos, aumento de la permeabilidad vascular y mantenimiento de la integridad vascular. VEGFR-1 posee una actividad quinasa mucho más débil y es incapaz de generar una respuesta mitogénica cuando se estimula por VEGF, aunque se une a VEGF con una afinidad que es aproximadamente 10 veces superior a KDR. VEGFR-1 también se ha implicado en la migración inducida por VEGF y factor de crecimiento de placenta (P1GF) de monocitos y macrófagos y en la producción de factor tisular.

Se expresan altos niveles de VEGFR-2, por ejemplo, por células endoteliales que infiltran gliomas (Plate, K. y col. (1992)), y están específicamente reguladas positivamente por el VEGF producido por glioblastomas humanos (Plate,

K. y col. (1993)). El descubrimiento de altos niveles de expresión de VEGR-2 en células endoteliales asociadas a glioblastoma (GAEC) sugiere que la actividad del receptor se induce durante la formación del tumor, puesto que los transcritos de VEGFR-2 apenas son detectables en células endoteliales cerebrales normales, indicando la generación de un bucle paracrino de VEGF/VEGFR. Esta regulación positiva está confinada a las células endoteliales vasculares en estrecha proximidad con el tumor. El bloqueo de la actividad de VEGF con anticuerpos monoclonales anti-VEGF (AcM) neutralizantes da como resultado la inhibición del crecimiento de xenoinjertos de tumor humano en ratones atímicos (Kim, K. y col. Nature, 362: 841-4 (1993)), sugiriendo un papel directo para el VEGF en la angiogénesis relacionada con tumores.

Por consiguiente, se han desarrollado antagonistas de VEGFR para tratar tumores vascularizados y otras enfermedades angiogénicas. Estos han incluido anticuerpos neutralizantes que bloquean la señalización por receptores de VEGF expresados en células endoteliales... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une selectivamente al receptor que contiene el dominio de inserto quinasa (KDR) humano, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende regiones determinantes de complementariedad representadas por la SEC ID Nº: 81 en la CDRL1; la SEC ID Nº: 82 en la CDRL2; la SEC ID Nº: 83 en la CDRL3; la SEC ID Nº: 13 en la CDRH1; la SEC ID Nº: 14 en la CDRH2; y la SEC ID Nº: 15 en la CDRH3.

2. El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera representado por la SEC ID Nº: 53 y un dominio variable de cadena pesada representado por la SEC ID Nº: 24.

3. El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo de cadena sencilla, un Fab, un Fv de cadena sencilla, un diacuerpo y un triacuerpo.

4. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. El polinucleótido de la reivindicación 4, en el que la secuencia de nucleótidos comprende la SEC ID Nº: 52.

6. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 5.

7. Una célula huésped recombinante que comprende el vector de expresión de la reivindicación 6.

8. La célula huésped recombinante de la reivindicación 7, que produce un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 24 y un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 53.

9. Un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en terapia.

10. Un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso en el tratamiento de enfermedades neoplásicas.

11. Un anticuerpo para el uso de la reivindicación 10, en el que la enfermedad neoplásica es un tumor del colon, un tumor de mama o un tumor no sólido.

12. Un anticuerpo para el uso de la reivindicación 10 u 11, en el que la enfermedad neoplásica es un tumor que sobreexpresa KDR.

13. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso antes, durante o después de comenzar la terapia con otro agente seleccionado de un antagonista de VEGFR-1, un antagonista de EGFR, un agente quimioterápico o radiación en el tratamiento de una enfermedad neoplásica.