Anticuerpos completamente humanos dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento 1 similar a la insulina humana.

Un anticuerpo humano aislado o fragmento del mismo que se une específicamente al receptor del factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-IR) que tiene al menos una propiedad seleccionada de

(i) inhibe la unión de IGF-I o IGF-II a IGF-IR;

(ii) neutraliza la activación de IGF-IR por el IGF-I o IGF-II;

(iii) reduce el receptor de la superficie IGF-IR en al menos un 80 %; y

(iv) se une al IGF-IR con una Kd de aproximadamente 3 x 10-10M o menos;

y tiene una cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que tienen una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 14 en VHCDR1, SEC ID Nº 16 en VHCDR2, y SEC ID Nº 18 en VHCDR3;

y una cadena ligera que comprende CDR que tienen una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 26 en VLCDR1, SEC ID Nº 28 en VLCDR2, y SEC ID Nº 30 en VLCDR3.

Anticuerpos completamente humanos dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento 1 similar a la insulina humana.

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE.UU. 60/467.177 presentada el 1 de mayo de 2003. 5

Antecedentes

El receptor del factor de crecimiento de tipo insulina (IGF-IR) es un receptor tirosina cinasa transmembrana ubicuo que es esencial para que el crecimiento y el desarrollo fetal y posnatal sean normales. El IGF-IR puede estimular la proliferación celular, la diferenciación celular, cambios en el tamaño de la célula, y proteger a las células de la apoptosis. También se ha considerado casi obligatorio para la transformación celular (recapitulación en Adams et al., 10 Cell. Mol. Life Sci. 57:1050-93 (2000) ; Baserga, Oncogene 19:5574-81 (2000) ) . El IGF-IR se localiza en la superficie celular de la mayoría de los tipos de células y sirve como molécula de señalización para los factores de crecimiento IGF-I e IGF-II (en conjunto denominados en el presente documento IGF) . El IGF-IR también se une a la insulina, aunque con una afinidad tres órdenes de magnitud menores que con la que se une a IGF. El IGF-IR es un heterotetrámero preformado que contiene dos cadenas alfa y dos beta unidas covalentemente por puentes disulfuro. 15 Las subunidades del receptor se sintetizan como parte de una cadena polipeptídica sencilla de 180 kd, que después se procesa proteolíticamente en las subunidades alfa (130 kd) y beta (95 kd) . Toda la cadena alfa es extracelular y contiene el lugar de unión al ligando. La cadena beta procesa el dominio transmembrana, el dominio tirosina cinasa y una extensión en C-terminal que es necesaria para la diferenciación y la transformación celulares, pero es innecesaria para la señalización de mitógenos y la protección frente a la apoptosis. 20

El IGF-IR es muy similar al receptor de la insulina (IR) , en particular dentro de la secuencia de la cadena beta (homología del 70 %) . Debido a esta homología, en estudios recientes se ha demostrado que estos receptores pueden formar híbridos que contienen un dímero IR y un dímero IGF-IR (Pandini et al., Clin. Conc. Res. 5:1935-19 (1999) ) . La formación de híbridos se produce en células tanto normales como transformadas y el contenido en híbrido depende de la concentración de los dos receptores homodiméricos (IR e IGF-IR) dentro de la célula. En un 25 estudio de 39 muestras de cáncer de mama, aunque tanto IR como IGF-IR estaban sobreexpresados en todas las muestras tumorales, el contenido en receptor híbrido superó de forma consistente los niveles de ambos homoreceptores aproximadamente 3 veces (Pandini et al., Clin. Canc. Res. 5:1935-44 (1999) ) . Aunque los receptores híbridos están compuestos por pares de IR e IGF-IR, los híbridos se unen de forma selectiva a los IGF, con una afinidad similar a la de IGF-IR, y solo se unen débilmente a la insulina ( (Siddle y Soos, The IGF System. 30 Humana Press. pp. 199-225. 1999) . Por tanto, estos híbridos se pueden unir a los IGF y transducen las señales en células normales y transformadas.

Un segundo receptor de IGF, el IGF-IIR, o receptor de manosa-6-fosfato (M6P) , también se une al ligando IGF-II con una afinidad elevada, pero carece de actividad tirosina cinasa (Oates et al., Breast Cancer Res. Treat. 47:269-81 (1998) ) . Debido a que da lugar a la degradación de IGF-II, se considera un sumidero para IGF-II, siendo un 35 antagonista de los efectos estimulantes del crecimiento de este ligando. La pérdida de IGF-IIR en las células tumorales puede aumentar el potencial crecimiento mediante la liberación de su efecto antagonista sobre la unión de IGF-II con el IGF-R (Byrd et al., J. Biol. Chem. 274:24408-16 (1999) ) .

La expresión endocrina de IGF-I está regulada principalmente por hormonas de crecimiento y se produce en el hígado, pero pruebas recientes sugieren que muchos otros tipos de tejido también son capaces de expresar IGF-I. 40 Por tanto, este ligando está sometido a regulación endocrina y paracrina, así como autocrina en el caso de muchos tipos de células tumorales (Yu, H. y Rohan, J., J. Natl. Cancer Inst. 92:1472-89 (2000) ) .

Se han identificado seis proteínas de unión a IGF (IGFBP) con afinidades de unión específica por los IGF en suero (Yu, H. y Rohan, J., J. Natl. Cancer Inst. 92:1472-89 (2000) ) . Los IGFBP pueden potenciar o inhibir la acción de los IGF, determinado por las estructuras moleculares de las proteínas de unión como resultado de las modificaciones 45 postraduccionales. Sus papeles principales son el transporte de IGF, protección de IGF frente a la degradación proteolítica y la regulación de la interacción de los IGF con IGF-R. Solo aproximadamente el 1 % del IGF-I en suero está presente como ligando libre y el resto está asociado con IGFBP (Yu, H. y Rohan, J., J. Natl. Cancer Inst. 92:1472-89 (2000) ) .

Tras la unión del ligandos (IGF) , el IGF-IR sufre autofosforilación en los residuos de tirosina conservados dentro del 50 dominio catalítico de la cadena beta. La posterior fosforilación de los residuos de tirosina adicionales dentro de la cadena beta proporciona sitios de anclaje para el reclutamiento de las moléculas aguas abajo cruciales en la cascada de señalización. Las rutas principales de la transducción de la señal del IGF son proteínas cinasas activadas por mitógeno (MAPK) y fosfatidilinositol-3-cinasa (PI3K) (revisado en Blakesley et al., En: The IGF System Humana Press 143-163 (1999) ) . La ruta del MAPK es principalmente responsable de la señal mitogénica provocada 55 tras la estimulación de los IGF y la PI3K es responsable de la inducción dependiente de IGF de procesos antiapoptóticos o de supervivencia.

Un papel clave de la señalización de IGF-IR es su función antiapoptótica o de supervivencia. El IGF-IR activado

señala el PI3K y la fosforilación aguas debajo de Akt, o la proteína cinasa B. Akt puede bloquear con eficacia a través de fosforilación moléculas tales como BAD, que son esenciales para el inicio de la muerte celular programada, e inhibir el inicio de la apoptosis (Datta et al., Cell 91:231-41 (1997) ) . La apoptosis es un importante mecanismo celular que es crucial para los procesos de desarrollo normal (Oppenheim, Annu. Rev. Neurosci. 14:453-501 (1991) ) . Es un mecanismo clave para efectuar la eliminación de células muy dañadas y reducir la potencial 5 persistencia de las lesiones mutagénicas que pueden estimular la tumorigénesis. Con este fin, se ha demostrado que la activación de la señalización de IGF puede estimular la formación de tumores espontáneos en un modelo de ratón transgénico (DiGiovanni et al., Cancer Res. 60:1561-70 (2000) ) . Adicionalmente, la sobreexpresión de IGF puede rescatar células de la muerte celular inducida por quimioterapia puede ser un importante factor en la resistencia a fármacos de células tumorales (Gooch et al., Breast Cancer Res. Treat. 56:1-10 (1999) ) . En 10 consecuencia, se ha demostrado que la modulación de la vía de señalización del IGF aumenta la sensibilidad de las células tumorales a los agentes quimoterapéuticos (Benini et al., Clinical Cancer Res. 7:1790-97 (2001) ) .

En un gran número de estudios de investigación y clínicos se ha implicado al IGF-IR y sus ligandos (IGF) en el desarrollo, mantenimiento y progresión del cáncer. En las células tumorales, la sobreexpresión del receptor, a menudo junto con la sobreexpresión de ligandos de IGF, conduce a la potenciación de estas señales y, como 15 resultado, a un aumento de la proliferación y supervivencia celular. Se ha demostrado que IGF-I and IGF-II son fuertes mitógenos para una amplia variedad de líneas de células cancerosas que incluyen cáncer de próstata (Nickerson et al., Cancer Res. 61:6276-80 (2001) ; Hellawell et al., Cancer Res. 62:2942-50 (2002) ) , de mama (Gooch et al., Breast Cancer Res. Treat. 56:1-10 (1999) ) , pulmonar, de colon (Hassan y Macaulay, Ann. Oncol. 13:349-56 (2002) ) , de estómago, leucemia, de páncreas, de cerebro, mieloma (Ge y Rudikoff, Blood 96:2856-61 20 (2000) , melanoma (All-Ericsson et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43:1-8 (2002) ) , y de ovarios (revisado en: Macaulay, Br. J. Cancer 65:311-20 (1990) ) y su efecto está mediado a través del IGF-IR. Niveles circulantes altos de IGF-I en suero se han asociado con un incremento del riesgo de cáncer de mama, de próstata y de colon (Pollak, Eur. J. Cancer 36:1224-28 (2000) ) . En un modelo de ratón de cáncer de colon, los incrementos de los niveles de IGF-I circulantes condujeron in vivo a un incremento significativo de la incidencia del crecimiento de los tumores y de 25 metástasis Wu et al., Cancer Res. 62: 1030-35 (2002) ) . Se ha demostrado que la expresión constitutiva de IGF-1 en células... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo humano aislado o fragmento del mismo que se une específicamente al receptor del factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-IR) que tiene al menos una propiedad seleccionada de

(i) inhibe la unión de IGF-I o IGF-II a IGF-IR;

(ii) neutraliza la activación de IGF-IR por el IGF-I o IGF-II; 5

(iii) reduce el receptor de la superficie IGF-IR en al menos un 80 %; y

(iv) se une al IGF-IR con una Kd de aproximadamente 3 x 10-10M o menos;

y tiene una cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que tienen una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 14 en VHCDR1, SEC ID Nº 16 en VHCDR2, y SEC ID Nº 18 en VHCDR3; 10

y una cadena ligera que comprende CDR que tienen una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 26 en VLCDR1, SEC ID Nº 28 en VLCDR2, y SEC ID Nº 30 en VLCDR3.

2. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, que tiene una región variable en la cadena pesada de SEC ID Nº 2 y una región variable en la cadena ligera de la SEC ID Nº 10.

3. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, que tiene todas las propiedades citadas. 15

4. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo reduce el IGF-IR de superficie en al menos aproximadamente 85 %.

5. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 4, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo reduce el IGF-IR de superficie en al menos aproximadamente 90 %.

6. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, que se une al IGF-IR con una Kd de 20 aproximadamente 5 x 10-11 M o inferior.

7. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, que inhibe la fosforilación de un sustrato aguas abajo de IFG-IR.

8. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 7, en el que el sustrato aguas abajo es seleccionado de MAPK, Akt, e IRS-2, y la fosforilación se inhibe en aproximadamente un 50 % o más. 25

9. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, que estimula la regresión del tumor in vivo.

10. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, que estimula la regresión del tumor in vivo cuando es administrado con un agente antineoplásico.

11. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el dominio variable de la cadena pesada tiene una homología de secuencia de al menos un 90 % con la SEC ID Nº 2. 30

12. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el dominio variable de la cadena ligera tiene una homología de secuencia de al menos un 90 % con la SEC ID Nº 10.

13. Una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Un conjugado que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 35 1 a 12 ligado a un agente citotóxico.

15. Un conjugado que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 ligado a un marcador.

16. Una composición terapéutica eficaz para inhibir el crecimiento de las células tumorales humanas que expresan IGF-IR y/o estimular la regresión de los tumores que expresan IGF-IR, en la que la composición comprende el 40 anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

17. La composición terapéutica de la reivindicación 16, que comprende además un agente anti-neoplásico.

18. La composición terapéutica de la reivindicación 17, en la que el agente antineoplásico es un inhibidor de la topoisomerasa I o de la topoisomerasa II.

19. La composición terapéutica de la reivindicación 17, en la que el agente antineoplásico es seleccionado de 45 irinotecán, camptotecán y etopósido.

20. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para su uso en el tratamiento de un trastorno proliferativo.

21. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 20, en el que el trastorno proliferativo es seleccionado de acromegalia, neovascularización en la retina y psoriasis.

22. Un procedimiento in vitro para inhibir el crecimiento de una célula que expresa IGF-IR, que comprende poner en 5 contacto la célula con una cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

23. El procedimiento de la reivindicación 22, que además comprender poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de un agente antineoplásico.

24. El procedimiento de la reivindicación 23, en la que el agente antineoplásico es un inhibidor de la topoisomerasa I 10 o de la topoisomerasa II.

25. El procedimiento de la reivindicación 23, en la que el agente antineoplásico es seleccionado de irinotecán, camptotecán y etopósido.

26. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para su uso en la reducción y/o prevención del crecimiento tumoral o la estimulación de la regresión tumoral. 15

27. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 26, en el que el uso comprende además administrar una cantidad eficaz de un agente antineoplásico.

28. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 27, en la que el agente antineoplásico es un inhibidor de la topoisomerasa I o de la topoisomerasa II.

29. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 27, en la que el agente 20 antineoplásico es seleccionado de irinotecán, camptotecán y etopósido.

30. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29, en el que el tumor es un tumor de mama, tumor colorrectal, tumor de páncreas, tumor de ovario, tumor de pulmón, tumor de próstata, hueso o sarcoma de tejidos blandos o mieloma.

31. Un inhibidor de la topoisomerasa I o la topoisomerasa II para su uso en la reducción o prevención del 25 crecimiento de un tumor que expresa IGF-IR o estimulación de la regresión de un tumor que expresa IGF-IR en combinación con un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente al IGF-IR y tiene al menos una propiedad seleccionada de:

(i) inhibe la unión de IGF-I o IGF-II a IGF-IR;

(ii) neutraliza la activación de IGF-IR por el IGF-I o IGF-II; 30

(iii) reduce el receptor de la superficie IGF-IR en al menos un 80 %; y

(iv) se une al IGF-IR con una Kd de aproximadamente 3 x 10-10M o menos;

y tiene una cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que tienen una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 14 en VHCDR1, SEC ID Nº 16 en VHCDR2, y SEC ID Nº 18 en VHCDR3;

y una cadena ligera que comprende CDR que tienen una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 26 en VLCDR1, 35 SEC ID Nº 28 en VLCDR2, y SEC ID Nº 30 en VLCDR3.

32. El inhibidor de la topoisomerasa I o la topoisomerasa II para su uso de acuerdo con la reivindicación 31, en el que el inhibidor de la topoisomerasa I o la topoisomerasa II es seleccionado de irinotecán, camptotecán y etopósido.

33. El inhibidor de la topoisomerasa I o la topoisomerasa II para su uso de acuerdo con la reivindicación 31, en el que el tumor es un tumor de mama, tumor colorrectal, tumor de páncreas, tumor de ovario, tumor de pulmón, tumor 40 de próstata, hueso o sarcoma de tejidos blandos o mieloma.

Figura 1

Figura 2

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Figura 19B

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Figura 21

Figura 22A

Figura 22B

Figura 22C

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Figura 25

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Figura 27