Anticuerpos contra el receptor 1 del factor de crecimiento endotelial vascular.

Un anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento del mismo que se une específicamente a VEGFR-1 que comprende:

(i) la LCDR1 que tiene la secuencia SEC ID Nº: 4;

(ii) la LCDR2 que tiene la secuencia SEC ID Nº: 2;

(iii) la LCDR3 que tiene la secuencia SEC ID Nº: 3;

(iv) la HCDR1 que tiene la secuencia SEC ID Nº: 11;

(v) la HCDR2 que tiene la secuencia SEC ID Nº: 12; y

(vi) la HCDR3 que tiene la secuencia SEC ID Nº: 13.

Anticuerpos contra el receptor 1 del factor de crecimiento endotelial vascular

Campo de la invención La presente invención se refiere a anticuerpos que son específicos para el receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 1 (VEGFR-1) y a procedimientos de tratamiento de enfermedades y tumores asociados con la angiogénesis con anticuerpos contra VEGFR-1.

Antecedentes de la invención Es conocido que la angiogénesis, que se refiere a la formación de capilares a partir de vasos preexistentes en el embrión y el organismo adulto, es un elemento clave en el crecimiento, la supervivencia y la metástasis tumoral. Se piensa que los factores de crecimiento y sus receptores, incluyendo el factor de crecimiento epidérmico (EGF) , el factor de crecimiento transformante-α (TGF-α) , factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) , factor de crecimiento de fibroblastos ácido y básico (aFGF y bFGF) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , juegan un papel en la angiogénesis tumoral. Véase Klagsbrun & D’Amore, Annual Rev. Physiol., 53: 217-239 (1991) . La unión de estos factores de crecimiento a sus receptores de la superficie celular induce la activación del receptor, que inicia y modifica las rutas de señalización celular y conduce a la proliferación y diferenciación celular. El VEGF, un mitógeno celular específico endotelial, se diferencia de estos factores en que actúa como un inductor de la angiogénesis promoviendo específicamente la proliferación de células endoteliales.

La respuesta biológica del VEGF está mediada a través de sus receptores de alta afinidad, que se expresan selectivamente en las células endoteliales durante la embriogénesis (Millauer, Cell, 72: 835-846 (1993) ) y durante la formación de tumores. Los receptores del VEGF (VEGFR) son típicamente tirosín quinasas de tipo receptor de clase III, que se caracterizan por tener varios bucles similares a los de las inmunoglobulinas, típicamente 5 o 7, en sus dominios amino-terminales extracelulares del receptor de unión a ligando (Kaipainen y col., J. Exp. Med., 178:20772088 (1993) ) . Las otras dos regiones incluyen una región transmembrana y un dominio catalítico carboxi-terminal intracelular interrumpido por una inserción de secuencias hidrófilas interquinasa de longitudes variables, denominado dominio de inserción de quinasas (Terman y col., Oncogene, 6:1677-1683 (1991) ) . Los VEGFR incluyen al receptor de tirosín quinasas similar a fins (flt-1) , o VEGFR-1, secuenciado por Shibuya y col., Oncogene, 5: 519-524 (1990) , al receptor que contiene un dominio de inserción de quinasas/quinasa hepática fetal (KDR/flk-1) , o VEGFR-2, descrito en el documento WO 92/14248, presentado el 20 de febrero de 1992, y en Terman y col., Oncogene, 6: 1677-1683 (1991) y secuenciado por Matthews y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 88: 9026-9030 (1991) , aunque otros receptores, tales como la neuropilina-1 y -2, también se pueden unir al VEGF. Otro receptor de tirosín quinasas, VEGFR-3 (flt-4) , se une a los homólogos de VEGF, VEGF-C y VEGF-D y es más importante en el desarrollo de los vasos linfáticos.

La importancia del VEGFR-1 en la regulación de la angiogénesis patológica se ha mostrado en modelos experimentales in vivo. El déficit del dominio tirosín quinasa del VEGFR-1 da como resultado la disminución de la formación de vasos sanguíneos en tumores, indicando un papel significativo de la tirosín quinasa del VEGFR-1 en la angiogénesis patológica (Hiratsuka y col., Cancer Research, 61:1207-1213 (2001) ) . El dominio tirosín quinasa del VEGFR-1 también se requiere para la promoción de la patogénesis y metástasis tumoral por medio de la inducción de la metaloproteasa de matriz 9 (MMP-9) en células endoteliales y macrófagos (Hiratsuka y col., Cancer Research, 61:1207-1213 (2001) ) . Además, se ha mostrado que el VEGFR-1 media la movilización y diferenciación de precursores procedentes de MO que responden a P1GF (Hattori y col., Nature Medicine, 8:841-849 (2002) ) . La inhibición del VEGFR-1 por medio de un anticuerpo anti-VEGFR-1 condujo a la reducción de la angiogénesis tumoral impidiendo la acumulación de células endoteliales procedentes de la médula ósea y progenitoras de macrófagos de la vascularización en tumores Ly den y col., Nature Medicine, 7:1194-1201 (2001) ) e inhibió el crecimiento del cáncer de mama (WU, PNAS 2004, 45, 694-695) . El tratamiento con un anticuerpo anti-VEGFR-1 también inhibió eficazmente la angiogénesis patológica en tumores y retina isquémica en modelos animales (Lutten y col., Nature Medicine, 8:831-840 (2002) ) .

Además del papel del VEGFR-1 en la angiogénesis, la co-expresión del VEGF y sus receptores se encuentra con frecuencia en células neoplásicas en enfermedades hematológicas y en determinadas células de tumores sólidos (Bellamy, Cancer Research, 59:728-733 (1999) ; Ferrer y col., Urology, 54:567-572 (1999) ; Price y col., Cell Growth Differ., 12:129-135 (2001) ) . Se ha mostrado que el VEGF induce directamente la proliferación, supervivencia e invasividad de las células de leucemia que expresan el receptor del VEGF por medio de la activación de rutas de señalización intracelular aguas abajo a través de un bucle autocrino estimulado por ligando (Dias y col., Proc Natl Acad Sci EE.UU., 98:10857-10862 (2001) ; Gerber y col., J Mol Med., 81:20-31 (2003) ) . La estimulación del VEGF también da como resultado un incremento de la invasividad de las células de cáncer de mama que expresan el VEGFR-1 induciendo la activación de las rutas de señalización de ERK 1/2 y de la PI 3/Akt-quinasa (Price y col., Cell Growth Differ., 12:129-135 (2001) ) .

También, el VEGFR-1 y sus ligandos han mostrado que juegan un papel importante en trastornos inflamatorios. El

déficit del VEGF-B da como resultado la reducción de la densidad de vasos asociada a la inflamación e inflamación sinovial en modelos de artritis (Mould y col., Arthritis Rheum., 48:2660-2669 (2003) ) . El PIGF también juega un papel crítico en el control de la inflamación cutánea por medio del agrandamiento vascular, células inflamatorias y monocitos/macrófagos, y se ha mostrado que contribuye a la modulación de la ateroesclerosis y artritis reumatoide en modelos animales (Luttun y col., Nature Medicine, 8:831-840 (2002) ; Autiero & Thromb Haemost., 1:1356-1370 (2003) ) . El tratamiento con un anticuerpo anti-VEGFR-1 neutralizante suprimió la destrucción inflamatoria de las articulaciones en la artritis, redujo el crecimiento de la placa aterosclerótica y su vulnerabilidad.

Los efectos antiinflamatorios del anticuerpo anti-VEGFR-1 fueron atribuibles a una movilización reducida de progenitores mieloides procedentes de la médula ósea a la sangre periférica, a una activación defectuosa de las células mieloides, y a una alteración de la diferenciación y la infiltración de los leucocitos que expresan VEGFR-1 en tejidos inflamados. Por lo tanto, el VEGFR-1 también puede ser una diana terapéutica para el tratamiento de los trastornos relacionados con la inflamación.

Wu Y. y col, Proceedings of the Annual Meeting of the American Association for Cancer Research, 1 de marzo de 2004, vol. 45, páginas 694-695 desvelan un anticuerpo monoclonal humano contra el VEGFR-1 del que se ha descrito que es capaz de inhibir el crecimiento de los cánceres de mama humanos.

Sigue existiendo la necesidad de agentes que inhiban la actividad del receptor del VEGF, tales como anticuerpos monoclonales (Acm) completamente humanos específicos para el VEGFR-1. Los anticuerpos anti-VEGFR-1 pueden ser un nuevo antagonista terapéutico, útil para el tratamiento de las enfermedades asociadas con angiogénesis y el cáncer.

Sumario breve de la invención En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento del mismo que se une específicamente al VEGFR-1 y que comprende

(i) una región determinante de la complementariedad de la cadena ligera 1 (LCDR1) que tiene la secuencia SEC ID Nº : 4;

(ii) una LCDR2 que tiene la secuencia SEC ID Nº :2;

(iii) una LCDR3 que tiene la secuencia SEC ID Nº :3;

(iv) una región determinante de la complementariedad de la cadena pesada 1 (HCDR1) que tiene la secuencia SEC ID Nº : 11;

(v) una HCDR2 que tiene la secuencia SEC ID Nº :12 y

(vi) una HCDR3 que tiene la secuencia SEC ID Nº :13;

En otra realización, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1.

En otra realización, la presente invención... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento del mismo que se une específicamente a VEGFR-1 que comprende:

(i) la LCDR1 que tiene la secuencia SEC ID Nº : 4;

(ii) la LCDR2 que tiene la secuencia SEC ID Nº : 2;

(iii) la LCDR3 que tiene la secuencia SEC ID Nº : 3;

(iv) la HCDR1 que tiene la secuencia SEC ID Nº : 11;

(v) la HCDR2 que tiene la secuencia SEC ID Nº : 12; y

(vi) la HCDR3 que tiene la secuencia SEC ID Nº : 13.

2. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o el fragmento del mismo de la reivindicación 1.

3. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 2 que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº : 23, y SEC ID Nº : 27, codificando la secuencia de nucleótidos un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a VEGFR-1.

4. Un vector de expresión que comprende la secuencia de polinucleótidos de la reivindicación 2 unida a una secuencia de expresión.

5. Una célula huésped recombinante que comprende el vector de expresión de la reivindicación 4.

6. La célula huésped recombinante de la reivindicación 5, en la que la célula expresa el anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 1.

7. Un procedimiento de producción de un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende cultivar la célula de la reivindicación 5 en condiciones que permitan la expresión del anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación

1.

8. Un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en terapia.

9. Un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en la inhibición de la angiogénesis en un mamífero.

10. Un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en la reducción del crecimiento tumoral en un mamífero.

11. El anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en la que dicho uso comprende adicionalmente administrar un agente o tratamiento antineoplásico.

12. El anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo de la reivindicación 1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el tumor es un tumor de mama.

Figuras 23A y B: Inhibición de la migración de células tumorales. (A) Durante 48 h se trataron células tumorales HT29 con 18F1 en presencia de VEGF-A o VEGF-B. La migración celular a través de una capa de Matrigel se representa como Media + ETM (*P < 0, 0001) . (B) Microfotografias de las células que migran teñidas con Diff-Quik. Datos de Pavco y col; Clin. Cancer Res. 2000; 6: 2094-103.

Figura 25A y B: Efecto de la monoterapia con 18F1 en xenoinjertos de cáncer de mama. (A) Ratones con xenoinjertos DU4475 se trataron con los anticuerpos 18F1, 6F9, o 15F11 contra VEGFR-1, a 1, 0 mg/dosis, L-X-V.

(B) Ratones con xenoinjertos MDA-MB-435 se trataron con 18F1 a las dosificaciones indicadas o con PBS a 0, 5 mg/dosis, L-X-V. Se representa el volumen tumoral medio ± ETM para n = 12 por grupo.

Figura 26A, B y C: Efecto de la monoterapia con 18F1 en xenoinjertos de cáncer de colon. Ratones con xenoinjertos HT-29 (A) , DLD-1 (B) , y GEO (C) se trataron con 18F1 a las dosificaciones indicadas, L-X-V, Se representa el volumen tumoral medio ± ETM para n = 10 por grupo.

231. Las secciones tumorales se tiñeron para Ki67, P-MAPK (14 días de tratamiento con 18F1 a 20 mg/kg, 2x/semana) , o ApopTag (7 días de tratamiento con 18F1 a 0, 5 mg/dosis, 3x/semana) . Se muestran secciones tumorales representativas. El control indica la dosis coincidente de IgG humana.

Figura 28A y B: Efecto de la inhibición combinada de VEGFR-1 de ratón y de ser humano sobre el crecimiento de xenoinjertos. Ratones con xenoinjertos MDA-MB-231 (A) o DU4475 (B) se trataron con 18F1, MF1 o la combinación, a las dosificaciones indicadas (2x/semana para 18F1 y 3x/semana para MF1) . Se representa el volumen tumoral medio ± ETM para n = 16-18 por grupo.

Figura 30A y B: Efecto del tratamiento con 5-FU/LV o Doxorrubicina en combinación con anticuerpos anti-VEGFR-1 de ratón y de ser humano sobre el crecimiento de xenoinjertos MDA-MB-231. Ratones con xenoinjertos MDA-MB231 se trataron con 18F1 + MF1 solo (3x/semana) , monoterapia de 5-FU/LV (c7d) (A) , doxorrubicina (2x/semana) (B)

o una combinación de anticuerpos más quimioterapia, a las dosificaciones indicadas. Se representa el volumen tumoral medio ± ETM para n = 12 por grupo

Figura 31A y B: Inhibición de la proliferación de células tumorales. Durante una noche se privó de suero a 2 x 104 células DU4475 seguido de tratamiento con desferrioxamina, después se incubaron con diversas cantidades de 18F1 (barra sombreada) o control de isotipo de lgG (barra blanca) en presencia de VEGF-A (A) o PIGF (B) . Después de 2 días de incubación, se determinó el número de células totales usando un contador celular Coulter. Los resultados se muestran como valor medio con error típico.

Figura 32A, B, y C: Especificidad de 18F1 y del anticuerpo anti-VEGFR-1 de ratón, MF1. 18F1 tiene actividad de unión con VEGFR-1 humano recombinante inmovilizado (A) pero no con VEGFR-1 de ratón (B) ni con VEGFR-2 humano (C) en comparación con el control positivo MF1 o con el anticuerpo específico de VEGFR-2, 1C11. El anticuerpo anti-VEGFR-1 de ratón, MF1 no se unió al VEGFR-1 humano recombinante inmovilizado (A) . 18F1 se usó como control positivo en el ensayo de unión en fase sólida.