MUTEÍNAS GP130 SOLUBLES CON ACTIVIDAD DE UNIÓN MEJORADA.

Muteínas GP130 solubles con actividad de unión mejorada La presente invención se refiere a muteínas de polipéptidos de glucoproteína gp130 con actividad de unión mejorada para el complejo de ligando que consiste en interleucina 6 (IL-6) y su receptor soluble (sIL-6R). En particular, un dímero polipeptídico que comprende dos muteínas idénticas del dominio extracelular de gp130 (gp130 soluble, sgp130) estando fusionada cada una con un dominio Fc de una proteína IgG (sgp130Fc) muestra bioactividad mejorada. La presente invención también se refiere a un composición farmacéutica que contiene polipéptidos de sgp130 mutados (muteínas de sgp130) o dímeros de los mismos y diversos usos médicos. La citocina pleiotrópica interleucina-6 (IL-6) muestra un amplio espectro de funciones biológicas entre las que la estimulación de linfocitos B e inducción de síntesis proteica de fase aguda en el hígado son más notables. IL-6 pertenece a la familia de citocinas de paquete de cuatro hélices. La estructura de la citocina consiste en cuatro hélices (A, B, C y D) conectadas por un bucle largo (AB), un bucle corto (BC) y de nuevo un bucle largo (CD). IL-6 señaliza mediante un complejo de IL-6, receptor de IL-6 (IL-6R) y dos moléculas gp130 en la superficie celular (Kishimoto y col. (1995) Blood 86:1243-54). La activación inducida por ligando del complejo conduce a la activación de quinasas Janus (JAK) que se fosforilan a sí mismas y la parte citoplasmática de gp130 (Darnell (1997) Science 277: 1630-5). Las formas solubles de IL-6R (sIL-6R), que se generan por corte y empalme alternativo o supresión también son capaces de desencadenar dimerización de gp130 y señalización cuando forman complejo con IL-6. Puesto que la parte citoplasmática del IL-6R no contribuye a transducción de señal, la señalización por un homodímero de gp130 puede inducirse por IL-6 en complejo con IL-6R soluble o unido a membrana. La presencia de sIL-6R, sin embargo, conduce a la sensibilización de células sensibles a IL-6 hacia el ligando. Además, las células de hibridoma estrictamente dependientes de IL-6 no proliferan en respuesta a cantidades muy bajas de IL-6 cuando sIL-6R presente en medio de cultivo se retira continuamente. Además de IL-6, gp130 también se usa por otros miembros de la familia de citocinas de paquete de cuatro hélices tales como IL-11, factor inhibidor de leucemia (LIF), citocina de tipo cardiotropina (CLC), oncostatina M (OSM), factor neurotrófico ciliar (CNTF), cardiotropina-1 (CT-1) y neuropoyetina (NPN) o la citocina recientemente descrita IL-27. Todas estas citocinas actúan mediante un complejo receptor bi o tripartito en el que la señalización se desencadena por homodimerización (para IL-6 e IL-11) o heterodimerización de gp130, por ejemplo con LIF-R (para LIF, CT-1, OSM, CLC y CNTF). Estas citocinas pueden por lo tanto mediar actividades biológicas similares en diversos tejidos. Aunque gp130 puede hallarse en casi todos los tipos celulares, el IL-6R muestra una expresión mucho más restringida. La liberación de sIL-6R por un tipo celular hace a otras células, que solamente expresan gp130, sensibles a IL-6. Este proceso se denomina trans-señalización. De hecho se han descrito varias actividades celulares que requieren el complejo de sIL-6R e IL-6 y no se observan con IL-6 solamente. En la citocina de diseño Hyper-IL-6 (H-IL-6), el extremo C terminal de sIL-6R se fusiona covalentemente con el extremo N terminal de IL-6 madura por un engarce peptídico flexible (Fischer y col. (1997) Nat. Biotechnol. 15: 142-5). Como se ha visto con el complejo de IL-6/sIL-6R, H-IL-6 también actúa en células que solamente expresan gp130. A diferencia de los componentes separados IL-6 y sIL-6R, una concentración de 100- a 1000- veces menor de esta molécula de fusión es suficiente para inducir señales biológicas comparables. IL-11, la otra citocina que señaliza a través de un homodímero de gp130, no muestra trans-señalización, puesto que el receptor de IL-11 no aparece en una forma soluble. Se halla proteína gp130 soluble constitutivamente en concentraciones altas en plasma humano y actúa como un tampón natural e inhibidor de trans-señalización de IL-6. Para el tratamiento de diversas enfermedades o trastornos, el bloqueo específico de respuestas de IL-6 dependientes de IL-6R soluble puede ser deseable. Tales enfermedades incluyen reabsorción de hueso, hipercalcemia, caquexia, tumores u otros tipos de cáncer (por ejemplo, cáncer de colon, mieloma múltiple, linfoma, leucemia, enfermedad de Hodgkin o enfermedad de Castleman), enfermedades autoinmunes (por ejemplo, esclerosis múltiple (MS), diabetes de tipo 1 o lupus eritematoso), enfermedades atópicas o inflamatorias (enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, asma, soriasis, sarcoidosis, uveítis o conjuntivitis alérgica), infecciones (por ejemplo, bacterias, virus, hongos u otros patógenos), sepsis, así como trastornos endocrinológicos y enfermedades metabólicas o catabólicas (por ejemplo, diabetes de tipo 2, obesidad, hiperglucemia o hipercolesterinemia). Se ha descubierto que, por ejemplo, los dímeros de sgp130 o dímeros de sgp130Fc son útiles para aplicaciones terapéuticas diseñadas para inhibir las acciones del complejo agonista de IL-6/sIL-6R. Las regiones de IL-6 que están en contacto con el IL-6R (soluble o unido a membrana) y gp130 se denominan sitio I, II e ITI. IL-6R está unido al sitio I de IL-6. El co-receptor gp130 pertenece a la clase de receptores de citocina altos, que muestran tres dominios de fibronectina (D4-D6) entre los dominios de unión a ligando y la región transmembrana de los receptores (Sprang y Bazan (1993) Curr. Opin. Struct. Biol. 3: 815-27). El domino de unión a ligando de gp130 también consiste en tres dominios (D1-D3): un domino de tipo inmunoglobulina (Ig) N terminal (D1) y dos dominios de tipo fibronectina tipo III (D2 y D3), de los cuales el segundo se denomina el módulo de unión a citocina (Grötzinger y col. (1999) Biol. Chem. 380: 803-13). Mientras que el dominio de tipo Ig N terminal de gp130 está en contacto con el sitio II de IL-6, el módulo de unión a citocina de gp130 se une al sitio II. La estructura 2   tridimensional del complejo hexamérico (IL-6/IL-6R/gp130)2 se ha resuelto (Boulanger y col. (2003) Science 300: 2101-4). Resulta interesante, sin embargo, que el sitio III de IL-6 no se ha resuelto completamente. La parte C terminal de la hélice A y la parte N terminal del bucle AB no se han resuelto, aunque esta región es parte del sitio de interacción entre IL-6 y gp130. Hasta el momento, no se han descrito variantes de gp130 que muestren actividad de unión mejorada. Por lo tanto, el problema técnico que subyace a la presente invención es proporcionar muteínas de sgp130 con actividad de unión mejorada, que puede usarse para construir polipéptidos o dímeros de sgp130 terapéuticos, por ejemplo sgp130Fc, con mayor actividad biológica y, por lo tanto, una mayor eficacia terapéutica, dosis terapéuticas menores eficaces y menor coste de productos en la producción farmacéutica. La solución de dicho problema técnico se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Se seleccionaron tres restos aminoacídicos (Thr102, Gln113 y Asn114) del domino de tipo Ig N terminal de gp130, que apuntan al área de interacción desconocida descrito anteriormente, para mutagénesis para detectar interacciones potencialmente más fuertes (véase esquema de mutación en la Figura 1). Sorprendentemente, se descubrió un aumento aditivo significativo en la actividad de unión y afinidad con tres intercambios de aminoácidos decididamente no conservativos (Thr102 mutado a Tyr102, abreviado Thr102Tyr o T102Y; Gln113 mutado a Phe113, abreviado Gln113Phe o Q113F; o Asn114 mutado a Leu114, abreviado Asn114Leu o N114L), lo que indica que el sitio de interacción de tipo silvestre sólo había evolucionado hasta un nivel de afinidad muy subóptimo para el complejo IL-6/(s)IL-6R. Como gp130 se une a múltiples y diversos ligandos, esto puede ser el resultado de un compromiso estructural evolucionado para acomodar todos los ligandos. Además, se demuestra que el efecto de las mutaciones descritas en la presente invención es específico para las estructuras IL-6/(s)IL-6R/gp130 humanas. Breve descripción de los dibujos Figuras 1: Muteínas de dominio N terminal de gp130 Los restos aminoacídicos Thr102, Gln113 y Asn114 del dominio de tipo inmunoglobulina (Ig) N terminal de gp130 se mutaron. Los cambios no conservativos de Thr102 a Tyr102 (mutación T102Y), Gln113 a Phe113 (mutación Q113F) y Asn114 a Leu114 (mutación N114L) tanto solos como en combinación mejoraron la actividad de unión de los dímeros de sgp130Fc (véase Figura 3). Figura 2: Gel de poliacrilamida nativo teñido con plata con preparaciones... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido que comprende (a) la parte extracelular completa de la glucoproteína gp130 o (b) variantes o fragmentos de dicha parte extracelular, siendo dicho polipéptido, variantes o fragmentos capaces de inhibir la actividad del complejo agonista IL-6/sIL-6R y en el que en dicha parte extracelular o variantes o fragmentos de la misma - Thr102 se sustituye por un resto aminoacídico neutro grande seleccionado de Tyr, Trp, Leu, Ile, Phe o Met, y/o - Gln113 se sustituye por un resto aminoacídico hidrófobo y no polar seleccionado de Phe, Trp, Ile, Leu, Met, Val o Ala, y/o - Asn114 se sustituye por un resto aminoacídico hidrófobo y no polar seleccionado de Phe, Trp, Ile, Leu, Met, Val o Ala. 2. El polipéptido de la reivindicación 1, caracterizado por al menos una de las siguientes substituciones: Thr102Tyr (T102Y), Gln113Phe (Q113F) y Asn114Leu (N114L). 3. El polipéptido de la reivindicación 2, en el que dos cualquiera de las mutaciones Thr102Tyr (T102Y), Gln113Phe (Q113F) o Asn114Leu (N114L) se combinan, dando como resultado las muteínas dobles Thr102Tyr/Gln113Phe (T102Y/Q113F), Thr102Tyr/Asn114Leu (T102Y/N114L) y Gln113Phe/Asn114Leu (Q113F/N114L). 4. El polipéptido de la reivindicación 2, en el que las tres mutaciones Thr102Tyr (T102Y), Gln113Phe (Q113F) y Asn114Leu (N114L) se combinan, dando como resultado la muteína triple Thr102Tyr/Gln113Phe/Asn114Leu (T102Y/Q113F/N114L). 5. El polipéptido gp130 mutado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el polipéptido está fusionado directamente o mediante un engarce polipeptídico con un marcador. 6. El polipéptido de una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 5, en el que el engarce polipeptídico que conecta el polipéptido gp130 mutado y su compañero de fusión es flexible y comprende de 2 a 50 restos aminoacídicos seleccionados de forma independiente del grupo que consiste en glicina, serina, asparagina, treonina y alanina. 7. El polipéptido de una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 6, en el que se insertan uno o más sitios de N- glucosilación entre el polipéptido gp130 mutado y el marcador, entre el polipéptido gp130 mutado y el engarce y/o entre el engarce y el marcador. 8. El polipéptido de una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho polipéptido está PEGilado. 9. El polipéptido de una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 8, que el polipéptido es un dímero con los dos monómeros enlazados entre sí a través de un engarce químico o físico. 10. El dímero polipeptídico de la reivindicación 9, en el que los dos monómeros son idénticos. 11. El dímero polipeptídico de la reivindicación 9 ó 10, en el que los dos monómeros se enlazan entre sí mediante un enlace covalente sencillo, un engarce polipeptídico flexible o uno o más puentes disulfuro. 12. El dímero polipeptídico de la reivindicación 11, en el que los monómeros están conectados por a un puente o puentes disulfuro, que se generan fusionando el monómero con un polipéptido de origen natural o artificial que comprende uno o más restos de cisteína libres y accesibles. 13. El dímero polipeptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que el polipéptido se fusiona con un dominio Fc de una proteína de inmunoglobulina, preferentemente en el que la inmunoglobulina es IgG, preferentemente en el que la proteína IgG es IgG1. 14. El polinucleótido que codifica un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13. 15. El polinucleótido de la reivindicación 14, en el que la secuencia polinucleotídica se optimiza con respecto a sus codones para la producción del polipéptido codificado en células huésped procariotas o eucariotas o en un sistema de expresión sin células. 16. Un vector de expresión que contiene un polinucleótido de la reivindicación 14 ó 15. 17. Una célula huésped o sistema de expresión sin células que contiene el vector de expresión de la reivindicación 16. 18. Un procedimiento para producir el monómero o dímero polipeptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende cultivar una célula huésped o usar un sistema de expresión sin células de la reivindicación 17 y recuperar y purificar el monómero o dímero polipeptídico de dicha célula huésped, el medio de cultivo o el sistema de expresión sin células. 18   19. Una composición farmacéutica que contiene un monómero o dímero polipeptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, un polinucleótido de la reivindicación 14 ó 15 o un vector de expresión de la reivindicación 16. 20. Una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o trastorno en el que el bloqueo del complejo agonista IL-6/sIL6R tiene un efecto beneficioso, comprendiendo dicha composición un monómero o dímero polipeptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, un polinucleótido de la reivindicación 14 ó 15 o un vector de expresión de la reivindicación 16 y en el que dicha enfermedad es reabsorción de hueso, hipercalcemia, caquexia, un tumor u otro tipo de cáncer, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria o atópica, una infección, sepsis, un trastorno endocrinológico o una enfermedad metabólica o catabólica. 21. Un anticuerpo que se une a un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que es específico para el motivo o los motivos peptídicos mutados o la región de engarce específica de dicho polipéptido. 22. Un procedimiento de diagnóstico in vitro que está basado en la detección de la unión de un anticuerpo de la reivindicación 21 con un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13. 19     21   22   23   24     26   27