MOLÉCULAS DE ANTICUERPO HUMANAS PARA IL-13.

Un miembro de unión específico aislado para IL-13 humana, que comprende un sitio de unión al antígeno de anticuerpo que está compuesto por un dominio VH de anticuerpo humano y un dominio VL de anticuerpo humano y que comprende un conjunto de CDR HCDR1,

HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en el que el dominio VH comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 y el dominio VL comprende LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en el que el conjunto de CDR consiste en un conjunto de CDR seleccionadas del grupo que consiste en: el conjunto de CDR de BAK278D6, definido en el que HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, LCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; y el conjunto de CDR de BAK502G9, definido en el que HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, LCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; en el que el miembro de unión específico se une a IL-13 humana e IL-13 de rhesus o cynomolgus

La presente invención se refiere a miembros de unión específicos, en particular a moléculas de anticuerpo anti-IL-13 humana y especialmente aquellas que neutralizan la actividad de IL-13. Se refiere además a moléculas de anticuerpo anti-IL-13 para usarse en el diagnóstico o tratamiento de trastornos relacionados con IL-13, incluyendo asma, dermatitis atópica, rinitis alérgica, fibrosis, enfermedad inflamatoria del intestino y linfoma de Hodgkin.

Las realizaciones preferidas de la presente invención emplean el dominio VH y/o VL del anticuerpo de la molécula de anticuerpo denominada en la presente memoria BAK502G9. Las realizaciones preferidas adicionales emplean las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de BAK502G9, especialmente VH CDR3 en otras regiones marco del anticuerpo. Los aspectos adicionales de la presente invención proporcionan composiciones que contienen miembros de unión específicos de la invención.

La presente invención proporciona moléculas de anticuerpo con un valor particular en la unión y neutralización de IL-13 y, por lo tanto, en el uso en cualquiera de numerosos tratamientos terapéuticos, como se indica por la experimentación contenida en la presente memoria y además por la bibliografía técnica de soporte.

La interleuquina (IL-)-13 es una citoquina de 114 aminoácidos con una masa molecular no modificada de aproximadamente 12 kDa [1,2]. IL-13 está muy relacionada con IL-4 con la que comparte un 30% de similitud de secuencia a nivel de aminoácidos. El gen de IL-13 humano está localizado en el cromosoma 5q31 adyacente al gen de IL-4 [1][2]. Esta región del cromosoma 5q contiene secuencias génicas para otras citoquinas derivadas de linfocitos Th2 incluyendo GM-CSF e IL-5, cuyos niveles junto con los de IL-4 se ha mostrado que se correlacionan con la gravedad de la enfermedad en asmáticos y modelos de roedores de inflamación alérgica [3] [4] [5] [6] [7] [8].

Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas IL-13 humana e IL-13 purificada se describen en WO 94/04680.

Aunque inicialmente se identificó como una citoquina derivada de linfocitos Th2 CD4+, IL-13 también se produce por las células T Th1 CD4+, linfocitos T CD8+ células NK y poblaciones de células no T tales como mastocitos, basófilos, eosinófilos, macrófagos, monocitos y células del músculo liso de las vías aéreas.

Se ha indicado que IL-13 media sus efectos a través de un sistema de receptor que incluye la cadena ≥ del receptor de IL-4 (IL-4R≥); que en sí mismo puede unirse a IL-4 pero no a IL-13 y al menos dos proteínas más de la superficie celular, IL-13R≥1 e IL-13R≥2 [9] [10]. IL-13R≥1 puede unirse a IL-13 con baja afinidad, reclutando posteriormente IL-4R≥ para formar un receptor funcional con alta afinidad que señaliza [11] [12]. La base de datos Genbank lista la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ácido nucleico de IL-13R≥1 como NP_001551 e Y10659 respectivamente. Los estudios en ratones deficientes en STAT6 (transductor de señales y activador de la transcripción 6) han revelado que IL-13, de manera similar a IL-4, señaliza utilizando la ruta JAK-STAT6 [13][14]. IL-13R≥2 comparte un 37% de identidad de secuencia con IL-13R≥1 a nivel de aminoácidos y se une a IL-13 con alta afinidad [15][16]. Sin embargo, IL-13R≥2 tiene una cola citoplásmica más corta que carece de restos de señalización conocidos. Las células que expresan IL-13R≥2 no responden a IL-13 incluso en presencia de IL-4R≥ [17]. Se postula, por lo tanto, que IL-13R≥2 actúa como un receptor señuelo que regula la función de IL-13 pero no de IL-4. Esto se ve apoyado por estudios en ratones deficientes en IL13R≥2 cuyo fenotipo era consistente con una respuesta incrementada a IL-13 [18] [19]. La base de datos Genbank lista la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ácido nucleico de IL-13R≥2 como NP_000631 e Y08768 respectivamente.

La señalización del complejo de receptor IL-13R≥1/IL-4R≥ se expresa en células B humanas, mastocitos, monocitos/macrófagos, células dendríticas, eosinófilos, basófilos, fibroblastos, células endoteliales, células epiteliales de las vías aéreas y células del músculo liso de las vías aéreas.

El asma bronquial es una enfermedad inflamatoria persistente común del pulmón caracterizada por la hiperrespuesta de las vías aéreas, sobreproducción de moco, fibrosis y niveles de IgE elevados en suero. La hiperrespuesta de las vías aéreas (AHR) es la constricción exagerada de las vías aéreas a estímulos no específicos tal como aire frío. Se piensa que tanto AHR como la sobreproducción de moco son responsables de la obstrucción variable de las vías aéreas que da lugar a la dificultad respiratoria característica de los ataques de asma (exacerbaciones) y que es responsable de la mortalidad asociada con esta enfermedad (alrededor de 2.000 muertes/año en el Reino Unido).

La incidencia del asma, junto con otras enfermedades alérgicas, se ha incrementado significativamente en los últimos años [20] [21]. Por ejemplo, actualmente, alrededor de un 10% de la población del Reino Unido (UK) ha sido diagnosticado como asmático.

Las directrices actuales de la British Thoracic Society (BTS) y de Global Initiative for Asthma (GINA) sugieren un método en etapas para el tratamiento del asma [22, 23]. El asma de suave a moderado puede controlarse habitualmente mediante el uso de corticosteroides inhalados, en combinación con agonistas beta o inhibidores de leucotrieno. Sin embargo, debido a los efectos secundarios documentados de los corticosteroides, los pacientes tienden a no seguir el régimen de tratamiento lo que reduce la eficacia del tratamiento [24-26].

Existe una necesidad clara de nuevos tratamientos para los sujetos con la enfermedad más grave, que frecuentemente obtienen un beneficio muy limitado de dosis más altas de corticosteroides inhalados u orales recomendadas por las directrices del asma. El tratamiento a largo plazo con corticosteroides orales está asociado con efectos secundarios tales como osteoporosis, velocidades de crecimiento ralentizadas en niños, diabetes y candidiasis oral [88]. Como tanto los efectos beneficiosos como adversos de los corticosteroides están mediados por el mismo receptor, el tratamiento es un equilibrio entre la seguridad y la eficacia. La hospitalización de estos pacientes, que representa alrededor del 6% de la población con asma de UK, como resultado de exacerbaciones graves representa la mayoría de la carga económica significativa del asma sobre las autoridades sanitarias [89].

Se cree que la patología del asma está causada por la inflamación en curso mediada por los linfocitos Th2 que resulta de respuestas inapropiadas del sistema inmune frente a antígenos no dañinos. Se ha recogido evidencia que implica a IL13, en lugar de la citoquina IL-4 clásica derivada de Th2, como el mediador clave en la patogénesis de la enfermedad de las vías aéreas establecida.

La administración de IL-13 recombinante a las vías aéreas de roedores sin estimular no sensibilizados causó muchos aspectos del fenotipo de asma incluyendo inflamación de las vías aéreas, producción de moco y AHR [27] [28] [29] [30]. Se observó un fenotipo similar en un ratón transgénico en el que IL-13 se sobreexpresó específicamente en el pulmón. En este modelo, una exposición más crónica a IL-13 también resultó en fibrosis [31].

Además, en modelos de roedores de enfermedad alérgica muchos aspectos del fenotipo del asma se han asociado con IL-13. Se ha mostrado que IL-13R≥2 soluble murina, un neutralizador de IL-13 potente, inhibe AHR, hipersecreción de moco y el influjo de las células inflamatorias que son características de este modelo de roedor [27] [28] [30]. En estudios complementarios, ratones en los que el gen IL-13 se había delecionado, no desarrollaron AHR inducida por alergenos. AHR pudo restaurarse en estos ratones deficientes en IL-13 por la administración de IL-13 recombinante. Por el contrario, los ratones deficientes en IL-4 desarrollaron enfermedad de las vías aéreas en este modelo [32] [33].

Usando un modelo de inflamación pulmonar inducida por alergeno a largo plazo, Taube et al. demostraron la eficacia de IL-13R≥2 soluble murina frente a enfermedad de las vías aéreas establecida [34]. IL-13R≥2 soluble murina inhibió AHR, la sobreproducción de moco y en menor medida la inflamación de las vías aéreas. Por el contrario, IL-4R≥ soluble, que se une y antagoniza IL-4,... [Seguir leyendo]

1. Un miembro de unión específico aislado para IL-13 humana, que comprende un sitio de unión al antígeno de anticuerpo que está compuesto por un dominio VH de anticuerpo humano y un dominio VL de anticuerpo humano y que comprende un conjunto de CDR HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en el que el dominio VH comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 y el dominio VL comprende LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en el que el conjunto de CDR consiste en un conjunto de CDR seleccionadas del grupo que consiste en:

el conjunto de CDR de BAK278D6, definido en el que HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, LCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; y

el conjunto de CDR de BAK502G9, definido en el que HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, LCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12;

en el que el miembro de unión específico se une a IL-13 humana e IL-13 de rhesus o cynomolgus.

2. Un miembro de unión específico aislado según la reivindicación 1, en el que HCDR1, HCDR2 y HCDR3 del dominio VH están en un marco de línea germinal y/o LCDR1, LCDR2 y LCDR3 del dominio VL están en un marco de línea germinal.

3. Un miembro de unión específico aislado según la reivindicación 2, en el que HCDR1, HCDR2 y HCDR3 del dominio VH están en el marco de línea germinal VH1 DP-14.

4. Un miembro de unión específico aislado según la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en el que LCDR1, LCDR2 y LCDR3 del dominio VL están en el marco de línea germinal VL %3-3H.

5. Un miembro de unión específico aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que se une a una variante de IL-13 humana en la que la arginina en la posición 130 está reemplazada por glutamina.

6. Un miembro de unión específico según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 que comprende el dominio VH de BAK502G9 (SEQ ID NO: 15).

7. Un miembro de unión específico según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 que comprende el dominio VL de BAK502G9 (SEQ ID NO: 16).

8. Un miembro de unión específico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que neutraliza IL-13 humana.

9. Un miembro de unión específico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que comprende una molécula de scFv de anticuerpo, o comprende una región constante de anticuerpo o comprende un anticuerpo completo, opcionalmente en el que el anticuerpo completo es IgG4.

10. Un dominio VH de anticuerpo aislado de un miembro de unión específico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Un dominio VL de anticuerpo aislado de un miembro de unión específico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

12. Una composición que comprende un miembro de unión específico, dominio VH de anticuerpo o dominio VL de anticuerpo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y al menos un componente adicional.

13. Una composición según la reivindicación 12 que comprende un excipiente, vehículo o transportador aceptable farmacéuticamente.

14. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un miembro de unión específico o dominio VH o VL de anticuerpo de un miembro de unión específico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

15. Una célula anfitriona transformada in vitro con un ácido nucleico según la reivindicación 14.

16. Un método para producir un miembro de unión específico o dominio VH o VL de anticuerpo, comprendiendo el método cultivar las células anfitrionas según la reivindicación 15 bajo condiciones para la producción de dicho miembro de unión específico o dominio VH o VL de anticuerpo.

17. Un método según la reivindicación 16 que comprende además aislar y/o purificar dicho miembro de unión específico

o dominio VH o VL variable de anticuerpo.

18. Un método según la reivindicación 16 o la reivindicación 17 que comprende además formular el miembro de unión específico o dominio VH o VL variable de anticuerpo en una composición que incluye al menos un componente adicional.

19. Un método para producir un dominio de unión al antígeno de anticuerpo específico para IL-13 humana, comprendiendo el método, proporcionar, por adición, deleción, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un dominio VH parental que comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3, en el que HCDR1, HCDR2 y HCDR3 del dominio VH parental son el conjunto de HCDR de BAK278D6, definido en el que HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o el conjunto de HCDR de BAK502G9, definido en el que HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, un dominio VH que es una variante de la secuencia de aminoácidos del dominio VH parental y opcionalmente combinar el dominio VH así proporcionado con uno o más dominios VL para proporcionar una o más combinaciones VH/VL; y

ensayar dicho dominio VH que es una variante de la secuencia de aminoácidos del dominio VH parental o la combinación o combinaciones VH/VL para identificar un dominio de unión al antígeno de anticuerpo específico para IL13 humana.

20. Un método según la reivindicación 19 en el que la secuencia de aminoácidos del dominio VH parental se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 13 y SEQ D NO: 15.

21. Un método según la reivindicación 19 o la reivindicación 20 en el que dichos uno o más dominios VL se proporcionan por adición, deleción, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un dominio VL parental que comprende LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en el que LCDR1, LCDR2 y LCDR3 del dominio VL parental son el conjunto de LCDR de BAK278D6, definido en el que LCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, o el conjunto de LCDR de BAK502G9, definido en el que LCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, produciendo uno o más dominios VL cada uno de los cuales es una variante de la secuencia de aminoácidos del dominio VL parental.

22. Un método según la reivindicación 21 en el que la secuencia de aminoácidos del dominio VL parental se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14 y SEQ D NO: 16.

23. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22 en el que dicho dominio VH que es una variante de la secuencia de aminoácidos del dominio VH parental se proporciona por mutagénesis de CDR.

24. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23 que comprende además proporcionar el sitio de unión al antígeno de anticuerpo en una molécula de IgG, scFv o Fab de anticuerpo.

25. Un método para producir un miembro de unión específico que se une a IL-13 humana, comprendiendo el método:

proporcionar un ácido nucleico de partida que codifica un dominio VH o un repertorio de partida de ácidos nucleicos cada uno que codifica un dominio VH, en el que el dominio VH o los dominios VH comprenden una HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3 que se va a reemplazar o que carecen de una región que codifica HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3;

combinar dicho ácido nucleico de partida o repertorio de partida con ácido nucleico donante o ácidos nucleicos donantes que codifican o producidos por mutación de la secuencia de aminoácidos de HCDR1 (SEQ ID NO: 1) o HCDR1 (SEQ ID NO: 7), HCDR2 (SEQ ID NO: 2) o HCDR2 (SEQ ID NO: 8) y/o HCDR3 (SEQ ID NO: 3) o HCDR3 (SEQ ID NO: 9) de manera que dicho ácido nucleico o ácidos nucleicos donantes se insertan en la región CDR1. CDR2 y/o CDR3 en el ácido nucleico de partida o repertorio de partida, para proporcionar un repertorio de productos de ácidos nucleicos que codifican dominios VH;

expresar los ácidos nucleicos de dicho repertorio de productos para producir como productos dominios VH;

opcionalmente combinar dichos dominios VH productos con uno o más dominios VL; seleccionar un miembro de unión específico específico para IL-13 humana, comprendiendo dicho miembro de unión específico un dominio VH producto y opcionalmente un dominio VL; y

recuperar dicho miembro de unión específico o ácido nucleico que lo codifica.

26. Un método según la reivindicación 25 en el que los ácidos nucleicos donantes se producen por mutación de dicha HCDR1 y/o HCDR2.

27. Un método según la reivindicación 25 en el que el ácido nucleico donante se produce por mutación de HCDR3.

28. Un método según la reivindicación 27 que comprende proporcionar el ácido nucleico donante por mutación del ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de HCDR3 (SEQ ID NO: 3) o HCDR3 (SEQ ID NO: 9).

29. Un método según la reivindicación 25 que comprende proporcionar el ácido nucleico donante por mutación aleatoria de ácido nucleico.

30. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 29 que comprende además unir un dominio VH producido que está comprendido en el miembro de unión específico recuperado a una región constante de anticuerpo.

31. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 29 que comprende proporcionar una molécula de IgG, scFv o Fab de anticuerpo que comprende el dominio VH producido y un dominio VL.

32. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 31 que comprende además ensayar el dominio de unión al antígeno del anticuerpo o miembro de union específico que se une a IL-13 humana para su capacidad de neutralizar IL-13 humana para identificar un dominio de unión al antígeno del anticuerpo o miembro de unión específico que se une y neutraliza IL-13 humana.

33. Un método según la reivindicación 32 en el que el fragmento de anticuerpo es una molécula scFv de anticuerpo o una molécula Fab de anticuerpo, opcionalmente en el que el método comprende además proporcionar el dominio VH y/o el dominio VL del fragmento de anticuerpo en un anticuerpo completo.

34. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 33 que comprende además formular el miembro de unión específico que se une a IL-13, sitio de unión al antígeno de anticuerpo o un dominio variable VH o VL de anticuerpo del miembro de unión específico o sitio de unión al antígeno de anticuerpo que se une a IL-13, en una composición que incluye al menos un componente adicional.

35. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 34 que comprende además unir un miembro de unión específico que se une a IL-13 humana a IL-13 o un fragmento de IL-13, en el que dicha unión tiene lugar in vitro.

36. Un método que comprende unir un miembro de unión específico que se une a IL-13 humana según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 a IL-13 humana o un fragmento de IL-13 humana, en el que dicha unión tiene lugar in vitro.

37. Un método según la reivindicación 35 ó 36 que comprende determinar la cantidad de unión del miembro de unión específico a IL-13 o un fragmento de IL-13.

38. Uso de un miembro de unión específico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en asma, dermatitis atópica, rinitis alérgica, fibrosis, enfermedad inflamatoria del intestino y linfoma de Hodgkin.